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目的探讨烹调油烟来源的细颗粒(PM2.5)对人脐静脉内皮细胞(HUVECs)氧化损伤和自噬的影响,并观察烹调油烟PM2.5诱导HUVECs自噬的相关分子机制,在细胞水平上初步探讨烹调油烟中的PM2.5通过损伤脐带导致不良妊娠结局相关分子细胞学机制,进一步为细颗粒物暴露导致不良妊娠结局的防治提供新思路和新靶点。方法1参照前期研究方法,用PM2.5采样器采集烹调油烟中PM2.5,增重法确定PM2.5质量,加DMSO溶解,调整浓度为100mg/m L的储备液。2用新配置的细胞培养液将100mg/m L烹调油烟PM2.5储备液稀释成不同的染毒浓度,处理细胞12、24、36小时,采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测烹调油烟PM2.5对HUVECs存活率的影响;DCFH-DA染色法检测细胞活性氧ROS的水平。3用0(溶剂对照,按1‰DMSO)、100μg/m L PM2.5、100μg/m L PM2.5+10mmol/L NAC、无血清50n M Rapamycin作用细胞24小时后,透射电镜观察自噬小体;细胞免疫荧光法检测自噬相关蛋白在细胞中的分布情况。4不同浓度PM2.5处理细胞不同时间,及添加NAC前后,Western blot法检测细胞内自噬相关蛋白LC3、Beclin1表达含量,并观察PI3K、AKT、m TOR蛋白的表达情况。结果1细胞存活率随着染毒浓度和时间的增加分别呈现剂量-反应关系和时间-反应关系;仅当染毒浓度为50、100、200μg/m L时,与对照组相比,细胞的存活率均显著下降,差异有统计学意义(P<0.01)。染毒36小时后,当烹调油烟PM2.5浓度达到200μg/m L,细胞存活率很低,而当浓度为100μg/m L,细胞存活率接近50%。根据MTT实验结果确定后续实验染毒浓度为0、25、50、100μg/m L。2荧光显微镜下,与溶剂对照组相比,100μg/m L PM2.5暴露组,细胞内绿色荧光在12h最强,且NAC能够抑制这种绿色荧光生成。通过定量分析发现,随着浓度的增加,ROS荧光强度有加强趋势,呈现一定的剂量-反应关系,而随着时间的增加,ROS荧光强度呈现递减的趋势;与对照组相比,染毒36小时,随着浓度的增加荧光强度基本没有变化。3透射电镜下,与对照组相比,100μg/m L PM2.5和Rapamycin处理组可见包含有细胞内容物的双层膜结构的自噬小体,且这些膜质丰富的自噬小体聚集,线粒体脊结构模糊,破碎状;而用NAC和100μg/m L PM2.5共孵育时,同单独用PM2.5处理组比较,自噬小体数量明显减少,没有出现聚集现象,且线粒体结构清晰可见。激光共聚焦显微镜下,与对照组相比,Rapamycin和PM2.5染毒组LC3、Beclin1表达含量均增加,LC3均匀围绕细胞核分布在细胞质中,形成一个个聚集的绿色点状,而Beclin1多堆集于细胞核外围,管状分布;而用NAC和100μg/m L PM2.5共孵育时,同单独用PM2.5染毒时比较,两蛋白表达含量明显减少。4同对照组相比,烹调油烟PM2.5增加了细胞内LC3II/LC3I比值及LC3II、Beclin1蛋白的表达量,且随着浓度和时间的增加,呈现一定的剂量-反应和时间-反应关系,在100μg/m L染毒和100μg/m L染毒36小时,与对照组相比差异均有统计学意义(P<0.05);NAC和3-MA均能抑制烹调油烟PM2.5对自噬相关蛋白表达的作用。PI3K、AKT、m TOR磷酸化蛋白占总蛋白比值随着染毒浓度的增加有下降的趋势,呈现剂量-反应关系,与对照组相比,均有统计学差异(P<0.05),与单独PM2.5染毒组比较,NAC共处理组能增加PI3K、AKT、m TOR磷酸化蛋白占总蛋白比值,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论烹调油烟PM2.5对HUVECs产生明显的细胞毒性和氧化损伤作用,且烹调油结果烟PM2.5能诱导细胞自噬,活性氧ROS介导的PI3K/AKT/m TOR信号通路参与到烹调油烟PM2.5诱导HUVECs自噬的过程中,NAC可能对细胞自噬的发生起到一个保护作用,可以推测NAC可能预防烹调油烟PM2.5通过损伤脐带血管而导致的严重后果,下一步将探讨细胞凋亡对内皮细胞的损伤作用及细胞自噬与凋亡之间的关系的研究,在细胞水平上进一步探讨不良妊娠结局发生的相关分子机制。