檀香醇(santalol)因其独特的香味和特性,在化妆品行业及医疗保健行业有着广泛的应用,且生物安全性良好。需求的增加导致檀香萜油的价格十分高昂,开发微生物生物炼制生产檀香醇是一条吸引研究者关注的新途径。本文的研究目标就是构建酿酒酵母生产檀香醇的基因组整合型菌株,通过CRISPR/Cas9基因编辑手段,将檀香烯合酶基因、CYP736A167及其还原酶CPR2整合至酿酒酵母染色体的多拷贝位点,形成遗传特性稳定、高效生产檀香醇的菌株,最后在10L发酵罐中提高檀香醇产量。首先将诱导型表达和组成型表达的黄皮果树来源檀香烯合酶基因SaSSy及tHMG1的两种基因组件整合至酿酒酵母delta位点,并证明了诱导型檀香烯生产菌株产量高于组成型菌株,在YPD(Gal)培养基中,整合型诱导表达菌株的檀香烯产量达到128.0 mg/L,是质粒型诱导表达菌株的4.17倍。然后将CYP736A167及其还原酶基因CPR2诱导型表达组件整合至酿酒酵母rDNA位点,在YPD(Gal)中发酵,z-α-檀香醇产量达到119.2mg/L,添加甘油后发酵产量达到160.5mg/L。同时也确定了 10L罐发酵采用从头诱导的方式。最后对所构建菌株进行驯化,控制初始培养基碳源比例,采用反馈流加补料的方式,对所构建的整合型檀香醇生产菌株进行10 L罐放大发酵,最终菌体干重达到15 g/L,产量达到269.3 mg/L,初步达到了高产檀香醇的目的。总之,本项目工作对这一重要天然产物今后的异源生产奠定了良好基础。