叶片是光合作用的主要器官,是碳水化合物的主要来源。叶绿体是进行光合作用的场所,光合作用效率的高低与叶绿素的含量、叶绿体形态和结构密切相关,这些变化会影响植物的光合作用和生长发育。叶色突变体是研究叶绿素合成、调控和降解以及叶绿体的发育和叶绿体-细胞核的信号传递的重要材料。水稻是禾谷类作物中基因组最小的物种,是研究禾谷类作物遗传和发育的模式植物。随着水稻基因组测序计划的完成以及相关技术的不断发展,通过构建各种水稻突变体库,利用正反向遗传学的方法来鉴定特定生物学过程中的重要基因,进而了解基因的功能,是后基因组时代的核心任务。本研究针对从恢复系选育和EMS诱变所获得的三份叶色突变体,即半显性黄叶自然突变体Chy(chlorophyll)、温敏型白条叶自然突变体st11(stripe11)和淡绿叶EMS诱变突变体pgl4(pale green leaf4),开展了突变体的形态学鉴定、叶绿体发育的电镜观察、遗传分析、光合生理测定、基因定位与克隆、载体构建、转基因功能验证和基因表达调控研究,其主要研究结果如下：1、遗传分析表明突变体Chy为单基因控制的半显性遗传模式。突变体Chy缺失叶绿素a和b,叶绿体发育受阻,呈液泡状,没有完整的类囊体,突变体Chy出芽后在三叶期致死。杂合体Chy/+为黄叶色,叶绿素a和b的含量在二叶期、苗期、分蘖期和抽穗期四个不同时期均比野生型要低,但杂合体Chy/+的叶绿素a/b比值在四个时期均比野生型要高,且较为稳定一致,杂合体Chy/+的叶绿体发育也存在部分紊乱。杂合体Chy/+的农艺性状与野生型相比,主要在株高、生育期和每穗粒数上差异显著。利用混合法将突变基因CHY初定位在Chr3的RM1164和RM8208之间,位于着丝粒附近,在此区间进一步设计11对分子标记引物,将突变基因CHY定位在着丝粒两侧的2.1Mb的范围内。2、利用网络资源和相关文献资料信息,查找发现一个位于BAC号为AC084767上的编码镁离子螯合酶Ⅰ亚基的CHLI基因(LOC_Os03g36540)可能与叶色突变体Chy的表型相关。测序结果表明CHLI基因的编码区第921个碱基由G突变成C,氨基酸由谷氨酸变成谷氨酰胺,突变位于CHLI基因的保守AAA+结构域上,突变体Chy与突变体chl9等位,基因CHLI为突变基因CHY的侯选基因。把突变基因CHY(包括启动子区、5’非翻译区和3’非翻译区在内)的6.9Kb的DNA片段连接到互补载体上,通过农杆菌介导法转入日本晴愈伤,获得5株阳性植株。与转空载体的日本晴对比,转基因植株T0代没有明显的叶色变化,T.代中分离出四分之一的(淡)黄叶植株,用转基因T1代中的(淡)黄叶色植株与突变体chl9进行杂交,F1验证T1代中分离出的(淡)黄叶植株是转基因互补植株,不是来自组培过程中叶色突变体。转基因进一步互补验证了突变基因CHY就是CHLI基因,突变基因CHY具有剂量效应。半定量RT-PCR检测发现CHY下调了叶绿素合成途径中的CHLH、PORA和CAO-1基因的表达,通过下调CHLH基因的表达间接影响了叶绿体的发育。同时CHY下调了编码叶绿体内蛋白的Cab1R、Cab2R、PsbA和RbcL基因的表达和上调了PsaA基因的表达。3、遗传分析鉴定EMS诱变的pgl4为隐性单基因控制的突变体,三叶期叶片为淡绿色,三叶期后只有新长出来的心叶为淡绿色,随着叶片完全展开而逐渐变绿。突变体在抽穗期叶绿素含量与野生型没有明显差异,但光合速率和气孔导度明显低于野生型。在三叶期,突变体pgl4的叶绿体的类囊体发育紊乱,出现液泡状,而在抽穗期与野生型没有差异。突变基因PGL4精细定位在某号染色体的21Kb的范围内,测序分析发现一个编码CLP蛋白水解酶的基因在ATG后的第926个碱基由G突变成A,突变位点位于基因的第二个内含子与第三个外显子的剪切位点,突变导致RNA的剪切位点向后移动了9个碱基。T-DNA插入敲除了基因的功能,导致植株白化致死。RNAi干涉的转基因苗心叶为淡黄叶,叶片全展后变成绿色。T-DNA插入和RNAi干涉结果进一步验证了基因PGL4编码了一个CLP蛋白水解酶。基因PGL4在根、茎、叶、鞘和穗等五个器官中均表达,但在叶和鞘中表达最高,根中表达最低。基因PGL4被T-DNA插入敲除后,下调了核基因OsGLK的表达,从而间接影响了编码叶绿体内蛋白的基因PsaA、PsbA和RbcL的表达。本研究还对叶色突变体用作标记性状在杂交育种上的应用进行了分析。4、突变体st1l从苗期开始叶片表现为白条状,穗颖壳成白色。在24℃处理下,突变体st1l叶片没有白条叶表型；在28℃处理下,突变体st1l叶片出现少量的白条纹；在32℃处理下,突变体st1l几乎成白化状,表明突变体st1l为高温敏感型白条叶,临界温度在28℃左右。遗传分析表明突变体st1l为单基因控制的隐性突变,但突变体的自交后代伴随出现白化致死苗,并具有细胞质效应,以突变体st1l为母本杂交,F,均出现一半的白化致死苗,其遗传模式还有待研究。利用混合法将突变基因STll初定位在Chr6短臂上的RM225和RM217之间,遗传距离为3.9cM。在此区间进一步设计5对分子标记,突变基因定位在标记RM584和WP-4之间的143Kb的范围内。在该范围内有12个具有全长cDNA支持的ORF,其中有一个编码核苷二磷酸还原酶大亚基的基因(LOC_Os06g07210),序列分析表明在该基因第15个外显子上有一个碱基发生错义突变,由G突变成了A,位于ATG起始后的第3859个碱基,氨基酸由甲硫氨酸变成异亮氨酸。突变体st1l在24℃、28℃和32℃处理下,基因ST1l表达没有明显差异。在32℃高温处理下,基因ST11下调了Cab1R和RbcL两个基因的表达。