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第一部分同型半胱氨酸对内皮细胞表达组织因子水平的影响目的研究同型半胱氨酸对原代培养的人大隐静脉内皮细胞组织因子(TF)表达水平的影响。方法采用酶消化法法原代培养人大隐静脉内皮细胞,倒置相差显微镜下观察细胞生长状态,通过Ⅷ因子免疫荧光法对培养细胞进行鉴定。选择生长良好的第3-4代细胞用于实验。分为(1)空白对照组:1640培养基;(2)Hcy浓度组:不同浓度的同型半胱氨酸(10、20、50、80、100μmol/L)培养细胞24h;(2)Hcy时间组:50μmol/L的同型半胱氨酸,培养不同的时间(2、4、8、24、48、72h)。各培养瓶中的细胞,经药物干预后收集细胞及培养上清液,采用LDH试剂盒检测各组培养上清液中LDH的活性,采用RT-PCR技术测定细胞中TF mRNA的表达,用ELISA方法检测上清液中TF水平。结果1.正常细胞生长良好,呈扁平多角形,边界清楚,胞质丰富,核圆形或椭圆形,居中,偶见双核,随细胞密度增加呈现“铺路石样”排列;荧光显微镜下可见细胞胞浆内均呈现绿色荧光,即胞浆内表达Ⅷ因子,符合内皮细胞特征。2.加入同型半胱氨酸后细胞粗糙,边界不整齐;同型半胱氨酸各浓度组的LDH活性都显著高于空白对照组(P＜0.05),差异有统计学意义(P＜0.05);同型半胱氨酸不同作用时间组,从4小时组开始,LDH活性逐渐增高,与空白对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05)。表明同型半胱氨酸同型半胱氨酸有直接的细胞毒作用。3.给予不同浓度同型半胱氨酸(10、20、50、80、100μmol/L)刺激24小时后,人大隐静脉内皮细胞TFmRNA及上清液中TF表达水平随同型半胱氨酸浓度的增加而升高(p＜0.05),即同型半胱氨酸干预与内皮细胞TF表达有剂量-效应关系,呈剂量依赖性。4.给予同型半胱氨酸50μmol/L作用于人大隐静脉内皮细胞不同时间,TF的表达从4小时开始升高,随刺激时间的延长,TF的表达持续升高,于72小时达到最高(p＜0.05),即呈时间依赖性。第二部分染料木黄酮对同型半胱氨酸诱导TF表达的干预作用目的研究染料木黄酮对同型半胱氨酸同型半胱氨酸诱导内皮细胞表达TF的干预作用。方法将细胞随机分组:(1)空白对照组;(2)Hcy组:50μmol/L的同型半胱氨酸,培养细胞24h;(3)染料木黄酮组:染料木黄酮(5,10,20,40,50mg/L),培养细胞24h;(4)染料木黄酮+Hcy组:染料木黄酮作用1h后再加入同型半胱氨酸(50μmol/L),培养不同时间(2、4、8、12、24、48、72h)后收集细胞。MTT法观察染料木黄酮药物对细胞增殖的影响,RT-PCR技术测定细胞中TFmRNA的表达,ELISA方法检测细胞培养液中TF浓度。结果1.不同浓度的染料木黄酮,分别作用6、12、24、48、72h,同对照组相比,细胞增殖能力无明显变化(P＞0.05)。说明干预药物本身对细胞没有毒性作用。2.用不同浓度的染料木黄酮预处理内皮细胞1h后,再加入同型半胱氨酸50μmol/L共孵育24小时,染料木黄酮对同型半胱氨酸所诱导的内皮细胞培养液中TF浓度的抑制,呈明显的量效关系(r=0.996,p＜0.05)。共孵育12小时,染料木黄酮对同型半胱氨酸所诱导的内皮细胞TFmRNA的抑制,呈明显的量效关系(r=0.992,p＜0.05)。3.40mg/L染料木黄酮预处理内皮细胞1h后,再加入同型半胱氨酸50μmol/L共孵育不同时间,染料木黄酮对同型半胱氨酸诱导TF蛋白表达水平的抑制具有明显的时间依从性,8小时开始,48小时抑制作用达高峰(r=0.972,p＜0.05)。染料木黄酮对同型半胱氨酸诱导TFmRNA表达水平的抑制具有明显的时间依从性,4小时开始,24小时抑制作用达高峰(r=0.982,p＜0.05)结论1.同型半胱氨酸对内皮细胞有直接的细胞毒性作用。2.同型半胱氨酸剂量依赖性和时间依赖性的上调血管内皮细胞TF的表达。3.染料木黄酮一定程度上可抑制同型半胱氨酸诱导的内皮细胞TF表达的上调,并具有剂量和时间依赖性。