慢性粒细胞白血病(Chronic Myelogenous Leukemia, CML),简称慢粒,是一种发生在造血干细胞的恶性骨髓增殖性疾病,是我国慢性白血病中最常见的一种类型。95%的慢粒具有Ph染色体,即特异性的t(9；22)(q34；q11)核型,并存在BCR-ABL1融合基因的表达。Ph染色体是9号和22号染色体长臂易位的结果,易位使9号染色体长臂(9q34)上的原癌基因ABL和22号染色体(22q11)上的BCR基因重新组合成BCR-ABL1融合基因。不同的BCR-ABL1融合基因类型与疾病表型相关。BCR-ABL1融合基因中,主要由ABL段携带细胞恶变的主要信息,ABL1属Abelson(白血病病毒)家族的非受体酪氨酸激酶,目前主要用于在恶性肿瘤中的研究,而BCR段的断裂位点主要影响疾病表型。在慢粒中,BCR-ABL1融合基因转录为8.5kb的mRNA,并进一步翻译产生分子质量为210KD的BCR-ABL1融合蛋白P210BCR/ABL,该蛋白具有异常酪氨酸激酶活性,其中ABL的SHl结构域TK活性异常,导致与ATP结合,使与ABL结合的信号转导蛋白发生磷酸化而激活,并作用于一系列下游的信号传导通路,包括RAS-MAPK通路、JAK-STAT通路、PI-3K激酶通路、MYC通路等,不但干扰调节细胞因子的增殖和抑制凋亡,而且引起造血干细胞调节生长和分化的必须黏附程序的缺失,最终导致骨髓祖细胞大量增生、凋亡减少与骨髓基质细胞粘附性下降,使大量不成熟的髓细胞释放到外周血,导致慢粒的发生。因此,BCR-ABL1融合基因被认为是慢粒发病的分子病理基础,也是慢粒诊断、疗效观察、预后等监测的有效指标。近年来以BCR-ABL1为靶点的研究主要集中在酪氨酸激酶抑制剂和相关信号转导通路上,和miRNA相关的研究很少。miRNA是一类长21-25nt的小分子非编码单链RNA的总称,由大约70nt大小的可形成发夹结构的前体加工而来,能够通过与靶mRNA特异性的碱基互补配对,引起靶mRNA降解或者抑制其翻译,从而对基因进行转录后的表达调控。miRNA在表达上具有组织和时间的特异性,是调节其他功能基因表达的重要调控分子,参与细胞增殖、凋亡、分化、代谢、发育、肿瘤转移等多种生物学过程。miRNA表达与多种肿瘤相关,大约50%得到注解的niRNA在基因组上定位于与肿瘤相关的脆性位点(fragilesite),这说明miRNA在肿瘤发生过程中起至关重要的作用。研究表明,microRNAs与肿瘤形成相关,既能发挥肿瘤抑制基因的作用,也能起到癌基因的作用。一个起肿瘤抑制基因作用的(?)niRNA表达下降或者缺失可能是由于miRNA生物合成的任何步骤发生缺陷造成的,而这最终将导致不适当的miRNA靶基因表达,最后可能导致细胞过度增殖、侵入、凋亡减少、不能正常分化或者去分化,引起肿瘤的形成。具有癌基因功能的(?)niRNA过表达也将导致肿瘤发生,在这种情形下,由于miRNA基因的扩增,持续性的启动子活性,miRNA加工的效率增高,或是miRNA的稳定性提高等,导致在异常组织或是不适当发育阶段这些miRNA的表达增加,导致其靶基因(抑癌基因)表达下降,引起肿瘤发生。本研究首先采用多个生物信息学预测软件预测靶基因可能是BCR-ABL1的miRNA,相关预测软件包括TargetScan、PicTa、miRBase、miRanda、Mirnaviewer、 DIANA TarBase,预测结果表明靶基因可能是BCR-ABL1的miRNA包括miR-196b和miR-30a;其次对miR-196b和miR-30a用生物信息学软件预测和慢粒关系密切的靶基因,综合各个软件的预测结果,表明miR-196b可能的靶基因包括BCR-ABL1和HOXA9, miR-30a可能的靶基因包括BCR-ABL1,因此本课题拟以miR-196b和miR-30a为研究对象,研究其在慢粒中的功能和表达调控。首先,以K562细胞总RNA为模板,扩增BCR-ABL1mRNA3’UTR序列和HOXA9mRNA3’UTR序列,与psiCHECKTM-2vector连接,构建重组质粒psiCHECKTM-2-BCR-ABL1-3’UTR、psiCHECKTM-2-HOXA9-3’UTR。其次,以重组质粒psiCHECKTM-2-BCR-ABLl-3’UTR、psiCHECKTM-2-HOXA9-3’UTR为模板,进行亚克隆。采用SOE的方法,扩增BCR-ABL1-3’UTR中niR-196b、 miR-30a结合位点种子序列分别突变的序列,扩增HOXA9-3’UTR中miR-196b结合位点的2个种子序列突变的序列,构建重组质粒psiCHECKTM-2-BCR-ABL1-3’UTR-Mutant-196b、psiCHECKTM-2-BCR-ABL1-3’UTR-Mutant-30a、psiCHECKTM-2-HOXA9-3’UTR-Mutant。其次,采用双荧光素酶报告基因检测系统进行靶基因的确认。设立mimics组、NC组、mutant组和mock组进行实验,在293T细胞中进行转染,48h后检测各组荧光值,结果用SPSS13.0的One Way ANOVA进行分析。统计分析结果表明196b mimics+ABL1和四个对照组间均存在显著性差异(P<0.05),即196bnimics降低了荧光值,而四个对照组间无显著性差异(P>0.05),表明miR-196b的靶基因包括BCR-ABL1;196b mimics+HOXA9和四个对照组间均存在显著性差异(P<0.05),即196bmimics降低了荧光值,而四个对照组间无显著性差异(P>0.05),表明miR-196b的靶基因包括HOXA9;30a mimics+ABL1和四个对照组间均存在显著性差异(P<0.05),即30amimics降低了荧光值,而四个对照组间无显著性差异(P>0.05),表明miR-30a的靶基因包括BCR-ABL1。为了进一步验证miRNA和靶基因的对应关系,我们对niR-196b和1niR-30a进行功能学研究。首先,以人基因组DNA为模板,扩增miR-196b前体pre-miR-196b和miR-30a前体pre-miR-30a,与载体plVTHM连接,构建慢病毒表达载体plVTHM-miR-196b和plVTHM-miR-30a。慢病毒表达载体分别和质粒psPAX2、pMD2.G共转染293T细胞,包病毒,用病毒液感染K562细胞,构建过表达lniR-196b细胞和过表达miR-30a细胞,并研究miRNA过表达细胞的增殖、周期、miRNA的表达,以及BCR-ABL1和HOXA9的表达。其次,对miRNA过表达细胞转染miRNA inhibitor,降低细胞中miRNA的表达,检测细胞的增殖、周期和BCR-ABL1和HOXA9的表达,判断回复情况。最后,对靶基因BCR-ABL1和HOXA9转染相应的siRNA,检测细胞的增殖、周期和BCR-ABL1和HOXA9的表达,判断细胞功能是否和过表达miRNA细胞功能一致。结果表明在K562细胞中过表达miR-196b后,细胞增殖明显抑制,G2期阻滞,：niR-196b表达升高,BCR-ABL1蛋白和HOXA9蛋白表达下降。在过表达miR-196b细胞中抑制miR-196b的表达后,细胞增殖增强(P<0.05),周期恢复,BCR-ABL1蛋白和HOXA9蛋白水平均升高。在K562细胞中过表达miR-30a后,细胞增殖明显抑制,G1期阻滞,miR-30a表达升高,BCR-ABL1蛋白表达下降。在过表达niR-30a细胞中抑制miR-30a的表达后,细胞增殖增强(P<0.05),周期恢复,BCR-ABL1蛋白水平明显升高。在K562细胞中转染ABL1siRNA后,BCR-ABL1mRNA水平下降,BCR-ABL1蛋白水平下降,细胞增殖抑制(P<0.05),G1期阻滞,和：miR-30a过表达细胞增殖情况基本一致。在K562细胞中转染HOXA9siRNA后,HOXA9mRNA水平下降,HOXA9蛋白表达水平下降,细胞增殖抑制(P<0.05),G1期阻滞,增殖比过表达miR-196b细胞快一些。细胞过表达研究和抑制表达研究的结果进一步证明：miR-196b的靶基因包括BCR-ABL1和HOXA9, miR-30a的靶基因包括HOXA9,且在慢粒中miR-196b和miR-30a都起到肿瘤抑制作用。miRNA的表达常常和表观遗传有关,表观遗传指DNA序列并不发生变化而基因表达却发生了可遗传的改变,其主要机制是由细胞内除遗传信息以外的其他可遗传物质所诱发且在细胞发育和增殖过程中能够稳定传递。表观遗传现象种类很多,但DNA甲基化和组蛋白修饰等表观遗传现象最常见,且与恶性肿瘤发生发展密切相关,特别是CpG岛甲基化所致抑癌基因转录失活和N端结构域转录后修饰,使DNA甲基化和组蛋白修饰成为目前表观遗传学和表观基因组学在肿瘤研究领域内重要分支。DNA甲基化主要包括整个基因组去甲基化和部分区域高度甲基化,其中DNA去甲基化在肿瘤发生发展中的作用尤为明显,另外组蛋白修饰也是基因表达调控以及诱发肿瘤形成的重要表观遗传机制之一。许多研究揭示,miRNA受甲基化和组蛋白修饰等表观遗传机制调控,表观遗传对miRNA分子产生重要的调控且直接参与肿瘤发生发展等过程。因此本课题下一步将研究miR-196b和]miR-30a在慢粒中的表达是否和表观遗传调控有关。首先,采用去甲基化药物5-Aza-2’-dc处理K562细胞,检测K562处理前后细胞的周期、凋亡、miR-196b和miR-30a的表达、BCR-ABL1和HOXA9的表达变化。其次,对miR-196b和miR-30a启动子CpG岛进行预测,并采用BSP法检测K562细胞在5-Aza-2’-dc处理前后miR-196b启动子CpG岛甲基化水平,根据BSP结果选出一段甲基化程度比较高、处理前后变化比较大的序列在临床样本中进行检测。最后,提取16例慢粒患者和10例正常人总RNA,检测miR-196b和miR-30a的表达水平,提取45例白血病患者和10例正常人基因组,采用MSP法检测miR-196b启动子CpG岛甲基化水平,采用SPSS13.0的多样本率比较χ2检验对MSP的结果进行统计学分析。K562细胞中的研究结果表明,K562用5-Aza-2’-dc处理后,G2期发生阻滞,增殖抑制,出现凋亡。K562细胞中miR-196b启动子CpG岛高甲基化,用甲基化转移酶抑制剂处理后,甲基化水平下降,BCR-ABLl蛋白和HOXA9蛋白水平均下降,但miR-196b的表达并未恢复,提示降低miR-196b启动子CpG岛甲基化水平,可使miR-196b的靶基因BCR-ABL1和HOXA9表达下降,但该作用是否通过改变miR-196b的表达来实现,需进一步研究。临床样本研究表明,慢粒患者中miR-196b的表达低于正常人,统计各类型白血病和正常人中甲基化阳性和甲基化阴性的比例,结果采用多样本率比较χ2检验进行分析,结果表明各类型样本间差异有显著性意义(P<0.05),其中CML中miR-196b启动子CpG岛甲基化和正常人相比有显著性差异(P<0.05),且CML中miR-196b启动子CpG岛甲基化阳性率高于正常人。结合细胞和临床样本研究结果,我们得到结论：慢粒中miR-196b低表达,降低miR-196b启动子CpG岛甲基化水平,可导致其靶基因BCR-ABL1和HOXA9表达下降,提示miR-196b启动子CpG岛高甲基化可能和慢粒发病有关。关于miR-30a (?)临床样本的研究表明,慢粒患者中miR-30a的表达低于正常人,细胞功能学研究表明miR-30a在慢粒中是抑癌基因,因此推测miR-30a的低表达和慢粒的发生机制有关,但是miR-30a启动子没有预测到有CpG岛,因此推测niR-30a的表达降低和miR-30a启动子CpG岛甲基化水平无关,另有其它机制,如niR-30a启动子发生突变,miR-30a存在杂合性缺失等,具体机制有待进一步研究。综上所述,本课题在生物信息学预测的基础上,采用双荧光素酶报告基因检测系统初步确认了miR-196b和miR-30a的靶基因,接着在K562细胞中进行了过表达和抑制表达研究,阐明了慢粒中miR-196b和：miR-30a的功能,证明了miR-196b的靶基因包括BCR-ABL1和HOXA9, miR-30a的靶基因包括BCR-ABL1,且在慢粒中miR-196b和niR-30a都起到肿瘤抑制作用。最后采用BSP法检测了K562细胞在用去甲基化药物处理前后miR-196b启动子CpG岛甲基化水平,并采用MSP法检测了45例白血病患者和10例正常人中miR-196b启动子CpG岛甲基化情况,并检测了miR-196b和1niR-30a在慢粒和正常人中的表达,结果提示慢粒中miR-196b启动子CpG岛的高甲基化可能和miR-196b的低表达有关,miR-196b的低表达是引起慢粒发病的机制之一,也为慢粒的治疗提供了一个潜在靶点。结果也表明miR-30a在慢粒中低表达且起到肿瘤抑制作用,推测1niR-30a的低表达和慢粒的发生机制有关,具体机制尚需进一步研究。