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目的:对布鲁氏菌检测阳性及阴性的哈萨克羊个体的DRB1基因外显子3利用PCR-SSCP技术,进行多态性检测,获得多态位点;构建酿酒酵母表面展示重组表达载体pYD1-DRB1;对绵羊DRB1基因外显子2两端进行点突变,引入特定酶切位点;构建绵羊DRB1基因酵母多态表面展示库;检测DRB1基因在酵母细胞表面的表达;用布鲁氏菌pmc221-GFP-M5免疫小鼠,检测外周血白细胞是否发光;探索初步构建布鲁氏菌抗原肽库的可行途径。为绵羊的育种及布鲁氏菌病的防治机理奠定基础,并提供一定的理论依据。方法:1、用虎红平板试剂盒对180只哈萨克羊样本进行布鲁氏菌检测,利用PCR-SSCP结合直接测序的方法,对哈萨克羊MHC-DRB1基因外显子3的多态位点进行检测。2、通过定点突变,在DRB1基因外显子2两端插入限制性酶切位点,构建绵羊DRB1基因酵母多态展示库,半乳糖诱导,通过细胞免疫荧光检测目的蛋白的表达。3、用布鲁氏菌pmc221-GFP-M5侵染小鼠,通过密度梯度离心分离外周血白细胞,激光共聚焦观察白细胞是否有绿色荧光。结果:1、利用虎红平板检测哈萨克羊布鲁氏菌感染率,在180只哈萨克羊中检测出146只阴性样本,34只阳性样本,阳性检出率为18.89%。2、利用PCR-SSCP技术结合直接测序的方法对哈萨克羊DRB1基因外显子3进行多态性检测,结果发现哈萨克羊DRB1基因外显子3中存在7个多态位点,分别是:T10C、C119T、G215C、A238G、T245G、G256A和C259T,且这些多态位点与哈萨克羊布鲁氏菌病的易感性无相关性。3、通过点突变成功引入了特定的酶切位点,构建绵羊DRB1基因酵母多态表面展示库,经半乳糖诱导表达,细胞免疫荧光检测,结果显示:绵羊DRB1基因在酵母表面成功表达并具有正确的空间构象。4、利用激光共聚焦观察密度梯度离心得到的白细胞,视野里有绿色荧光出现。结论:1、通过对哈萨克羊MHC-DRB1基因的外显子3序列的多态性进行检测,结果表明:哈萨克羊DRB1基因外显子3序列具有较低的多态性。2、成功构建了绵羊DRB1基因酵母多态展示库,半乳糖诱导后,在激光共聚焦下有绿色荧光出现,表明:DRB1蛋白在酵母细胞表面表达成功。说明此种方法可以适用于绵羊MHCⅡ类基因的真核表达。3、通过密度梯度离心,激光共聚焦下观察,检测到白细胞中有绿色荧光出现。说明pmc221-GFP-M5布鲁氏菌能成功侵入白细胞中,并使其发光。