论文部分内容阅读
泛肽-核糖体蛋白S27a(ubiquitin-ribosomal protein S27a,uBRPS27a)是泛肽和核糖体蛋白的融合蛋白,N端是泛肽,C端是有C2-C2型锌指结构域的高度保守的核糖体蛋白。在真核细胞中表达时,被酶解成泛肽和核糖体蛋白。N端的泛肽蛋白主要参与细胞内的蛋白质选择性降解过程;C端的核糖体蛋白S27a在翻译过程中不可缺少。已发现核糖体蛋白S27a在人结肠癌细胞中过表达,是一个早期生长反应基因;在胰腺癌细胞和临近胰腺癌细胞的癌前病变组织中也超常表达;在肝癌细胞里也高表达;在胃癌细胞中,该基因的表达也远高于胃正常黏膜上皮细胞。总之,这个多功能核糖体蛋白在各种活性增殖细胞和瘤组织中高度表达,在多种类型的肿瘤细胞中,该基因的过量表达是一个典型特征。
在对家蚕蛹cDNA文库测序中,我们发现一个编码家蚕泛肽一核糖体蛋白S27a基因的序列,我们对其进行生物信息学的分析并将其命名为:BmUBRPS27a。为研究BmUBRPS27a的功能,将该基因的ORF插入到融合表达载体pET-28a(+)的相应酶切位点,成功构建了原核表达质粒pET-28a(+)-BmUBRPS27a,并转化感受态细胞E.coli BL21(DE3)经IPTG诱导表达后,将裂解菌体的上清和沉淀分别进行SDS-PAGE检测,与阴性对照相比在23.28 kDa处有一特异性条带,与预期值一致。重组蛋白以可溶的形式表达,通过亲和层析纯化了重组蛋白并使用该重组蛋白免疫新西兰兔制备多克隆抗体,效价为1:51200。利用多克隆抗体对家蚕UBRPS27a进行亚细胞定位,结果显示细胞核与细胞质中都有分布。同时还进行了荧光定量:PCR分析不同组织、时期该基因的表达差异,定量内参选用18srRNA,结果表明在各组织中,脂肪体和肠中的表达量最低,丝腺中表达量最高;在卵、幼虫、蛹和蛾四个发育时期中,蛹的表达量最高,卵和幼虫中表达量较低。我们合成了BmUBRPS27a的dsRNA进行RNAi,用脂质体转染家蚕卵巢上皮细胞:Bm5后,发现了细胞的形态发生了变化:细胞由圆形、椭圆形变成了梭形,甚至出现类似神经细胞的突触结构。对这一变化的机制,我们还将继续对此研究。