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开花是植物从营养生长时期向生殖生长的转换,是植物生命周期中的一个重要发育阶段,它决定了植物能否完成有性繁殖。开花时间的早晚,决定了果实,种子等主要植物产品产量上市时间。因此植物开花的研究对于生产和育种具有重大的经济价值。芥菜作为一种十分重要的十字花科类蔬菜作物,在我国各地都有着一定的种植面积。开花时间除了受光照(如日照强度,长度)、温度等外在环境的影响,还受植物生长状态、发育阶段、遗传因素等内在条件影响。主要有自主途径、春化途径、光周期途径和赤霉素途径四条途径调控芥菜开花。虽然这四条途径都有着各自的下游基因调控网络,但最终都会汇集到开花整合子,完成开花调控。目前已经发现了一些的与植物开花相关的基因,如FLOWERINGLOCUS T (FT), SUPPRESSOR OF CO OVEREXPRESSIONI(SOC1),FLOWERINGLOCUS C (FLC),SHORT VEGETATIVE PHASE(SVP)等,其中FT与SOC1促进开花、FLC与SVP抑制开花。SVP基因最早在拟南芥中发现,它是从早花型突变体中通过En-1转座子第一个被确认,位于第2条染色体上,具有抑制开花的作用。SVP蛋白属典型的MIKC型蛋白,含有一个保守性较强的MADS域和K域,以及保守性稍弱的I域和C域。本实验室前期研究发现芥菜SVP基因编码的蛋白也为MIKC型MADS域蛋白。FLC是一个关键的开花抑制基因,属于MADS-box基因,其编码的的蛋白质属于MADS-box转录因子。本实验室前期研究证明,芥菜FLC与SVP蛋白相互作用,形成一个二聚复合物,对环境信号进行共同介导,抑制下游开花整合子FT与SOC1的表达,进而抑制植物开花。同时发现,FLC与SVP互作域为K域,但是K域可以分为K1,K2,K3三个亚域究竟是哪个亚域对蛋白互作起决定性作用,目前仍不清楚。故本研究对芥菜FLC与SVP的互作亚域进行了筛选。1、芥菜FLC与SVP亚域的克隆及酵母载体的构建本研究以实验室保存的芥菜酵母重组质粒pGADT7-FLC、pGADT7-SVP、 pGBKT7-FLC、pGBKT7-SVP序列为参照,设计引物。分别亚克隆了芥菜SVP的全长与7个截短体：BjSVP (MIKC)编码241个氨基酸、BjSVP△1(Ⅰ)编码57个氨基酸、BjSVP△2(K)编码78个氨基酸、BJSVP△3(IK)编码111个氨基酸、BjSVP△4(1K1L1K2L2编码86个氨基酸、BjSVP△5(IK1L1K2)编码80个氨基酸、BjSVP△6(IK1L1)编码64个氨基酸、BjSVP△7(IK1)编码52个氨基酸；以及FLC全长与5个截短体：BjFLC (MIKC)编码197个氨基酸、BjFLC△1(I)编码57个氨基酸、BjFLC△2(K)编码54个氨基酸、BjFLC△3(IK)编码115个氨基酸、BjFLC△4(IK1K2)编码108个氨基酸、BjFLC△5(IK1)编码78个氨基酸。同时构建各个片段的酵母双杂交重组表达载体,分析由K域亚域介导的FLC与SVP异源、同源蛋白相互作用的亚域。利用同源重组技术,构建了FLC与SVP各个截短体的酵母表达载体pGBKT7-BjFLC、pGBKT7-BjFLC△1～5、pGBKT7-BjSVP以及pGADT7-BjSVP、pGADT7-BjSVP△1～7、pGADT7-BjFLC。利用醋酸锂转化法将重组酵母质粒转化到感受态酵母中,得到酵母转化子Y2Hgold[pGBKT7-BjFLC]、Y2Hgold[pGBKT7-BjSVP]、 Y2Hgold[pGBKT7BjFLC△1～5]和Y187[pGADT7BjSVP].Y187[pGADT7BjFLC]、Y187[pGADT7BjSVP△1～7]。在毒性检测中,转入pGBKT7重组载体的转化子经SD/-Trp筛选发现各重组质粒对Y2Hgold菌株无毒性,转入pGADT7重组载体的转化子经SD/-Leu筛选发现各重组质粒对Y187菌株无毒性。在自激活检测中,转入pGBKT7重组载体的转化子经SD/-Trp、SD/-Trp/X-a-Gal、SD/-Leu/-Trp (DDO)、SD/-Trp/X-a-Gal/AbA培养基的逐层筛选发现各转化子在Y2Hgold菌株中不存在自激活现象；转入pGADT7重组载体的转化子经SD/-Leu、 SD/-Leu/X-a-Gal、SD/-Leu/-Trp(DDO)、SD/-Leu/X-a-Gal/AbA培养基的逐层筛选发现各转化子在Y187菌株中不存在自激活现象。2、K域亚域介导的FLC与SVP异源蛋白相互作用Y187[pGADT7-BjSVP△1～7]分别与Y2Hgold[pGBKT7-BjSVP]转化菌落两两组合,融合酵母中Y187[pGADT7-BjSVP△2～7]×Y2HGold[pGBKT7-BjFLc]、Y187[pGADT7-BjSVP]×Y2HGold[pGBKT7-BjFLC]在SD/-Trp/-Leu/-Ade/-His/X-α-G al/AbA(QDO/X-α-Gal/AbA)平板上可以长出蓝色菌落。由此推测在FLC与SVP的异源蛋白相互作用中,BjSVP蛋白K域的K1亚域是该相互作用的结合域。β-半乳糖苷酶活性检测和方差分析表明：在异源蛋白相互作用过程中,BjSVP K蛋白中的K2亚域可以加强蛋白的相互作用,K3亚域和L1连接区对蛋白互作强度没有影响,L2连接区对蛋白的相互作用具有削弱作用。Y2HGold[pGBKT7-BjFLC△1～5]分别与Y187[pGADT7-BjSVP△7]两两融合,融合菌Y2HGold[pGBKT7-BjFLC]×Y187[pGADT7-BjSVP△7]、Y2HGold[pGBKT7-BjFLC△2～5]×Y187[pGADT7-BjSVP△7]可以在SD/-Trp/-Leu/-Ade/-His/X-α-Gal/AbA (QDO/X-α-Gal/AbA)平板上长出蓝色菌落。由此推测在BjFLC蛋白中K域的K1亚域是该相互作用的结合域。β-半乳糖苷酶活性检测和方差分析表明：在异源蛋白相互作用过程中FLC蛋白K域中的K2亚域可增加作用强度,而K3亚域可减弱蛋白作用强度。3、K域亚域介导的SVP与FLC同源蛋白相互作用在SVP与SVP同源蛋白互作域筛选实验中,转化子Y187[pGADT7-BjSVP△1～7]与转化子Y2Hgold[pGBKT7-BjSVP]分别两两融合,融合菌Y187[pGADT7-Bj SVPA2]xY2HGold[pGBKT7-BjSVP]、Y187[pGADT7-BjSVP△3]xY2HGold[pGBKT7-BjSVP]可以在SD/-Trp/-Leu/-Ade/-His/X-a-Gal/AbA (QDO/X-a-Gal/AbA)平板上长出蓝色菌落。因此推测SVP同源蛋白相互作用中完整的K域(K1L1K2L2K3)是BjSVP自身互作所必须的,K域亚域的缺失会破坏自身蛋白的互作。在FLC与FLC同源蛋白互作域筛选试验中,转化子Y2Hgold[pGBKT7-BjFLC△1-5]与转化子Y187[pGADT7-FLC]两两融合,融合菌Y2Hgold[pGBKT7-FLC△2～5]×Y187[pGADT7-FLC]均可在SD/-Trp/-Leu/-Ade/-His/X-a-Gal/AbA (QDO/X-a-Gal/AbA)平板上长出蓝色菌落。由此推测FLC同源蛋白相互作用中,BjFLC的K域、IK域、IK1K2、IK1均可与BjFLC蛋白自身相互作用,K1亚域是BjFLC同源互作的关键区域。β-半乳糖苷酶活性检测和方差分析检测：在BjFLC蛋白同源相互作用过程中,K2、K3亚域会削弱同源蛋白作用强度。