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研究背景:鼻咽癌是人类头颈部恶性肿瘤之一,虽然近年来鼻咽癌的诊断技术和治疗方法取得了巨大的进步,但是因为肿瘤本身存在复发、远处转移和治疗耐受,鼻咽癌病人的生存率并没有得到显著提高。越来越多的实验研究结果证明泛素特异性肽酶22(Ubiquitin-specific processing enzyme22,USP22)具有干细胞样表达模式,在肿瘤形成和发展的病理过程中扮演着关键的角色,并与多种类型肿瘤患者的不良预后密切相关。USP22逐渐被认识为能够早期判断病情和预测治疗效果的肿瘤干细胞标记基因之一。近年来的研究让我们有理由推测USP22 mRNA、蛋白水平高表达可能是鼻咽癌发生发展过程中的关键点之一,也可能是潜在的治疗靶点。然而,目前为止,USP22在鼻咽癌中的表达情况及其扮演的角色仍然不是很明确。本研究的前期实验工作基础是:已成功构建了USP22 shRNA慢病毒载体稳定干扰CNE-1细胞系和CNE-2细胞系,为进一步研究USP22对人鼻咽癌细胞的生物学作用奠定了实验基础。本研究的目的是研究USP22在鼻咽癌中的表达水平和其对鼻咽癌细胞的生长、增殖和细胞周期过程的影响,并进一步探索它病理致病的分子机制。 研究方法: 第一部分:使用免疫组化、实时定量RT-PCR方法检测USP22基因在鼻咽癌组织及正常鼻咽粘膜组织中的表达水平。通过Western blot、实时定量RT-PCR技术检测USP22在鼻咽癌细胞系中的表达水平,并与正常鼻咽上皮细胞中的USP22水平进行对比。 第二部分:前期实验已成功利用USP22特异性shRNA干扰USP22的表达,并且成功构建了USP22-shRNA慢病毒载体稳定干扰CNE-1、CNE-2细胞系,并且通过一段无关序列shRNA构建阴性对照组细胞。本论文是在前期的实验基础上进一步用细胞计数方法、MTS方法来检测USP22沉默后对细胞生长、增殖活性的影响,用流式细胞仪检测USP22沉默后对细胞周期的调控作用;并进一步用Western blot技术检测USP22沉默后Bmi-1、PTEN和PI3K/Akt信号通路相关的关键蛋白的变化,初步探索USP22在鼻咽癌发生发展过程中可能的分子机制。 研究结果: 1.对鼻咽癌患者及癌旁远端正常鼻咽粘膜组织进行比较,免疫组化及RT-PCR显示USP22mRNA及蛋白在鼻咽癌组织中的表达水平明显高于鼻咽正常粘膜组织。Western blot、RT-PCR检测结果显示,鼻咽癌细胞系CNE-1、CNE-2细胞中USP22的表达水平较正常对照组明显增高。 2.利用细胞计数法及MTS法检测细胞生长增殖活性并描绘细胞生长曲线,结果表明在USP22沉默后肿瘤细胞CNE-1、CNE-2的生长增殖活性被明显抑制了。而阴性对照组细胞的生长增殖没有明显被抑制。 3.流式细胞术检测细胞周期显示USP22沉默后CNE-1、CNE-2细胞中G0/G1期细胞数量增多了,S期和G2/M期细胞数减少了。这表明USP22表达沉默后主要是通过诱导G0/G1期的细胞周期阻滞来减少鼻咽癌细胞的增殖。 4. USP22表达沉默后,CNE-1、CNE-2细胞中的Bmi-1、p-AKT、 p-GSK-3β和cyclinD1的表达水平较阴性对照组下调,PTEN的表达水平上调,这初步表明USP22基因参与了鼻咽癌细胞周期转录信号通路的调控,参与的信号通路初步判断为PI3K/Akt信号通路。 研究结论: 此研究表明:USP22在鼻咽癌组织和细胞中高表达,用shRNA技术可以有效下调USP22基因的表达水平,USP22沉默后可明显抑制鼻咽癌CNE-1、CNE-2细胞系的生长和增殖,并使细胞周期阻滞在G0/G1期,其作用机制可能是通过调控PI3K/Akt信号通路。由此推测,USP22在鼻咽癌的病理致病过程中扮演着关键的角色,并可能是未来潜在的生物分子靶向治疗的靶点。