【摘 要】
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目的应用慢病毒介导的RNA干扰技术抑制MSK1的表达,初步探究下调MSK1对大鼠脊髓损伤后炎症反应、细胞凋亡、星形胶质细胞增殖和运动功能恢复的影响。旨在探讨MSK1在脊髓损伤修复中的作用及机制。从而为脊髓损伤的基础研究及临床治疗提供新的思路和靶点。方法1.将慢病毒感染高分化PC12细胞,并分为空白对照组(NC)、慢病毒阴性对照组(LV-GFP)、干扰组1(MSK1siRNA1)、干扰组2(MSK1
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目的应用慢病毒介导的RNA干扰技术抑制MSK1的表达,初步探究下调MSK1对大鼠脊髓损伤后炎症反应、细胞凋亡、星形胶质细胞增殖和运动功能恢复的影响。旨在探讨MSK1在脊髓损伤修复中的作用及机制。从而为脊髓损伤的基础研究及临床治疗提供新的思路和靶点。方法1.将慢病毒感染高分化PC12细胞,并分为空白对照组(NC)、慢病毒阴性对照组(LV-GFP)、干扰组1(MSK1siRNA1)、干扰组2(MSK1siRNA2)和干扰组3(MSK1siRNA3),通过荧光显微镜观察转染效率;利用Western blot检测MSK1的表达,验证其体外干扰效率。2.把大鼠随机分为手术组和假手术组,手术组为脊髓损伤模型组,假手术组只进行椎板切除处理,不损伤脊髓组织。采用椎管内局部注射法将慢病毒载体转染入脊髓组织,在荧光显微镜下观察慢病毒注射后不同时间点脊髓组织绿色荧光的表达情况,确定病毒最佳转染时间点。3.把大鼠随机分为SCI组(单纯脊髓损伤)、LV-GFP组(脊髓损伤后注射阴性对照慢病毒)和LV-MSK1组(脊髓损伤后注射MSK1siRNA慢病毒)。Western blot检测慢病毒转染后7、14d MSK1蛋白的表达水平,验证体内干扰效率。4.下调MSK1的表达后,Western blot检测脊髓损伤后相关的炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10和增殖细胞核抗原PCNA的表达变化;采用免疫荧光染色法检测PCNA、胶质纤维酸性蛋白GFAP和凋亡相关蛋白Caspase3的表达变化;通过TUNEL染色检测细胞凋亡;通过透射电子显微镜镜观察脊髓神经元的超微结构变化;根据BBB评分,评估大鼠脊髓损伤后后肢运动功能的恢复情况。从而探讨MSK1下调对脊髓损伤后炎症反应、细胞凋亡、星形胶质细胞增殖和运动功能恢复的影响。结果1.慢病毒转染72h后,各组中PC12细胞均在荧光显微镜下观察到大量的绿色荧光,大约80%的细胞被慢病毒感染。转染96h后,MSK1siRNA1、MSK1siRNA2和MSK1siRNA3组中MSK1蛋白的表达量显著低于NC和LV-GFP组。与LV-GFP组相比,MSK1-siRNA2慢病毒载体具有最高的干扰效率。2.慢病毒转染大鼠脊髓后第1天观察到绿色荧光表达。荧光在第3天和第5天逐渐增强。在第7天,达到峰值。在第14天,荧光表达逐渐减弱。3.慢病毒注射后7d和14d,LV-MSK1组中的MSK1蛋白表达均显著低于SCI和LV-GFP组。4.Western blot结果显示:与SCI和LV-GFP组相比,LV-MSK1组中TNF-α,IL-6和IL-1β、PCNA蛋白表达量明显升高;而IL-10蛋白表达量显著降低。5.免疫荧光染色表明:LV-MSK1组中PCNA和GFAP阳性细胞的平均免疫荧光强度和NeuN+Caspase3阳性细胞数显著高于LV-GFP组;TUNEL染色显示LV-MSK1组中TUNEL阳性细胞的数量明显高于LV-GFP组。6.透射电镜下观察到:SCI和LV-GFP组的神经元出现细胞凋亡的典型特征,如神经元细胞核固缩,染色质浓缩,核膜皱折,髓鞘形态不规则、变薄。而LV-MSK1组,神经细胞发生细胞膜严重受损,线粒体肿胀,并且伴有脱髓鞘变现象的超微结构变化。7.大鼠后肢运动功能BBB评分显示LV-MSK1组在损伤后第5,7和14天均低于SCI和LV-GFP组。结论1.MSK1siRNA慢病毒载体能有效地转染高分化PC12细胞和大鼠脊髓组织,并在体外和体内均有效地抑制MSK1的表达。2.下调MSK1的表达可促进SCI后的炎症反应、星形胶质细胞增殖和细胞凋亡,并抑制SCI后大鼠运动功能的恢复。3.MSK1可能通过调控炎症反应、星形胶质细胞增殖和细胞凋亡在大鼠脊髓损伤修复中发挥一定的作用。
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