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体细胞核移植技术为生产转基因动物核心技术之一,该技术的优化和成熟,对于成功生产转基因动物至关重要。本研究针对生产转基因牛中核移植技术的关键环节进行了系统研究,同时利用实验室已经构建好的人溶菌酶基因(human lysozyme, hLYZ)乳腺特异性表达载体pEBH和人β-防御素-3基因(humanβ-defension-3, hBD3)乳腺特异性表达载体pEBB分别转染牛成纤维细胞,经G418筛选4周后得到了纯化的转基因阳性细胞并用于核移植,经阳性胚胎筛选后进行胚胎移植,得到了20头2~8个月妊娠阶段受体母牛。主要研究内容如下:1.用组织块法成功分离了3头荷斯坦新生牛皮肤成纤维细胞和1头荷斯坦40 d胎儿的成纤维细胞。并对不同个体来源的新生牛成纤维细胞原代培养和传代培养细胞增殖和生长特性等进行比较,表明不同个体来源的新生牛成纤维细胞体外培养生长速度和核型方面没有显著性差异。同时比较了新生牛皮肤成纤维细胞和胎儿成纤维细胞生长特性及核型,胎儿成纤维细胞在原代培养时,4 d后铺满皿底,新生牛皮肤成纤维细胞8 d后才铺满皿底。表明胎儿成纤维细胞原代培养生长速度高于新生牛皮肤成纤维细胞。但经过传代培养后生长速度差异不明显。并且发现不同个体来源的新生牛皮肤成纤维细胞和胎儿成纤维细胞支持克隆胚胎的体外发育能力无显著性差异。2.比较了卵巢运输过程中在15℃、20℃、25℃、30℃温度下,对卵母细胞的回收、成熟及支持克隆胚的发育的影响,表明卵巢在保存温度为20℃和25℃时,A、B级卵母细胞的回收率分别为60.2%和64.0%,显著高于15℃和30℃时A、B级COCs的回收率(48.4%、40.1%)(P<0.05),卵巢保存在15℃、20℃、25℃,体细胞克隆胚的卵裂率分别为76.0%、75.0%、74.5%,囊胚发育率分别为29.2%、20.2%、22.4%,各组之间没有显著性差异,但分别显著高于30℃组(卵裂率和囊胚发育率分别为43.8%和8.3%)。3.在成熟培养液中添加1 ng/mL、10 ng/mL、100 ng/mL的瘦素(leptin),卵母细胞的体外成熟率分别为68.0%、81.0%、77.0%,克隆胚的囊胚发育率分别为18.4%、30.4%、24.4%。结果表明成熟培养液中添加10 ng/mL的leptin能显著提高克隆胚的囊胚发育率(P<0.05)(30.4% vs 17.3%)。4.比较了两种培养液mSOF和G1.1/G1.2对牛体细胞克隆胚发育的影响。结果发现两种培养液对体细胞克隆胚胎的发育速度、外观形态有显著的影响。G1.1/G1.2培养液培养的胚胎在8-细胞以后发育速度明显快于mSOF液培养的胚胎,在mSOF液中培养的胚胎桑葚胚致密化及囊胚扩张更明显;两种培养液对体细胞克隆胚的卵裂及囊胚发育率没有显著影响,但mSOF液培养的囊胚孵化率显著高于G1.1/G1.2培养液培养的囊胚(31.5% vs 21.3%, P<0.05);G1.1/G1.2培养液培养的囊胚内细胞凋亡率显著低于mSOF液培养的囊胚(8.5±1.2% vs 16.8±1.5%, P<0.05);两种培养液对囊胚内内细胞团细胞和滋养层细胞的比例没有显著影响;两培养液组得到的胚胎在移植后40 d的妊娠率差异不显著,但60 d以后,G1.1/G1.2培养组的妊娠率显著高于mSOF液培养组(23.3% vs 46.1%,P<0.05)。5.研究发现用秋水仙碱处理MII期卵母细胞,能使89.3%的卵母细胞在核区形成胞突,去核成功率能达到98.5%,显著高于常用的盲吸去核法(P<0.05)。6.挑选直径为15～20μm的细胞做核移植供核细胞时,重构胚的囊胚发育率显著高于直径为10μm或25μm的细胞组(P<0.05)。7.与传统的槽式融合法相比,微电极融合法能显著提高重组体的融合率(85.6% vs 66.7%,P<0.05),但这两种融合方法对体细胞克隆胚的早期发育没有显著影响。8.血清饥饿、接触抑制及生长期细胞对体细胞克隆胚的发育没有显著的影(P>0.05)。9.分别用本实验室构建好的hLYZ基因乳腺特异性表达载体pEBH和hBD3乳腺特异性表达载体pEBB转染牛成纤维细胞,经G418筛选4周后得到了纯化的转基因阳性细胞。用优化的卵母细胞成熟方法、核移植程序及克隆胚的培养方法生产得到了转基因克隆胚。10.研究发现,细胞转染外源基因后,支持克隆的囊胚发育率为20.6%,显著低于非转染的细胞(36.3%)(P<0.05)。11. 2头新生犊牛的成纤维细胞经转染后作为供体细胞,支持转基因克隆胚的体外发育率分别为18.4%和19.4%,个体之间差异不显著,经转染后胎儿成纤维细胞支持囊胚发育率为34.0%,显著高于两新生牛皮肤成纤维细胞囊胚发育率(P<0.05)。转基因克隆胚胎移植后60 d孕检,新生牛不同个体之间以及胎儿成纤维细胞和新生牛成纤维细胞构建的转基因克隆胚胎移植妊娠率无统计学差异。12.转基因克隆胚从4-细胞开始有7.8%(4/51)能观察到绿色荧光,到囊胚阶段有40.9%(18/44)能观察到绿色荧光。13.用转hLYZ基因的克隆胚共移植受体牛133头次,2个月后共有11头受体牛维持妊娠,妊娠率为8.3%;移植转hBD3基因阳性胚胎受给152头次受体牛,3个月后检测有9头维持妊娠,妊娠率为5.9%。