论文部分内容阅读
目的:细菌脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)是革兰氏阴性细菌(Gram-negativebacterium,GNB)细胞壁外膜层的主要成分。LPS在细菌生长繁殖、死亡破裂或裂解后释放。一旦进入人或敏感动物体内,造成宿主各系统、器官损伤。LPS不仅是决定GNB感染(如脓毒症和感染性休克)的主要致病因子,而且与人类许多疾病密切相关,LPS是一种危及人类健康乃至生命的重要病原相关模式分子(PAMPs);LPS还有广泛的生物学活性,不仅能激活T、B、M(ф)NK等免疫细胞,还能促进细胞因子生成、活化补体,对免疫系统发挥多方面的调节功能:LPS作为一种免疫增强剂,能抗感染、抗辐射、增加机体免疫力、保护造血组织,并有促白细胞增生作用。本研究通过诱变育种筛选促白细胞增生作用强、治疗指数高的菌种;筛选出粘质沙雷氏菌诱变菌体的最佳固体培养基配方;采用高效液相色谱仪(HPLC)测定LPS的分子量;通过治疗Balb/c小鼠白细胞减少症模型进一步验证LPS的促白细胞增生作用;采用霍恩氏(Horn)法检测LPS的半数致死量LD50。
方法:采用紫外诱变法对粘质沙雷氏菌体进行诱变,三氯乙酸法提取纯化LPS,通过家兔促白细胞增生实验,测定LPS促白细胞增生作用,筛选出促白细胞增生作用强、治疗指数高的菌种;采用单因素和正交试验,分别对培养基中的碳源、氮源、温度和pH值进行筛选,并且对碳源、氮源及无机盐进行优化,筛选出最佳固体培养基配方;通过高效液相色谱仪(HPLC)测定LPS的分子量;利用环磷酰胺建立Balb/c小鼠白细胞减少症模型,并用LPS隔同腹腔注射治疗5次,检查血常规、胸腺和脾脏指数、骨髓有核细胞(BMNC)记数、骨髓象分析、G-CSF和IL-6活性,经统计学处理各种检测指标,验证LPS促白细胞的增生作用;采用霍恩氏(Hom)法,利用剂量递增法测定LPS的半数致死量LD50。
结果:通过紫外诱变筛选菌种,进行细菌培养,提取纯化LPS和家兔促白细胞增生实验,筛选出了促白细胞增生作用强、治疗指数高的粘质沙雷氏菌诱变1min菌种;进行单因素和正交设计试验,筛选和优化了培养基配方,确定了粘质沙雷氏菌诱变1min菌的最佳固体培养基配方;通过三氯乙酸(TCA)法提取纯化LPS,经过真空冷冻干燥制得LPS干粉,得率达到了4.6％;通过紫外扫描蛋白质特定吸收波长,检测LPS干粉中蛋白含量甚微;利用HPLC检测LPS的分子量为117.280KD。利用LPS治疗环磷酰胺所致的白细胞减少症模型的Balb/c小鼠,验证了LPS的促白细胞增生作用显著(LPS治疗组与模型组比较P＜0.05),急性毒性实验采用霍恩氏(Hom)法计算出LPS的LD50为1.14mg/kg。
结论:紫外诱变的粘质沙雷氏菌种,促白细胞增生作用显著、治疗指数高;筛选和优化了最佳固体培养基配方,提高了产菌量和LPS得率;TCA法提取纯化LPS,明显减少蛋白质杂质,达到了纯化目的;LPS对环磷酰胺诱导白细胞减少症的Balb/c小鼠具有促进骨髓细胞、造血干/祖细胞增殖、促白细胞增生和恢复造血功能作用,根据治疗组小鼠的胸腺指数升高,说明LPS有免疫增强作用。