玉米作为全世界范围内最重要的粮食、饲料和能源作物,在农业生产中占有相当大的比例。随着全球性气候变暖,高温及干旱胁迫已经成为一个全世界农业面临的共同问题,严重影响着植物的生长发育和包括玉米在内的粮食作物产量。植物叶片的气孔是植物与环境之间进行气体交换和散失水蒸气的门户,因此在碳同化、呼吸、蒸腾作用等植物代谢过程中发挥重要生理功能。在高温和干旱胁迫下,植物能够通过关闭气孔以减少水分散失,所以,通过研究植物气孔运动的调节机制以及细胞信号转导过程,挖掘参与植物高温和干旱胁迫应答的功能基因,并深入研究其分子机制,将为提高植物水分利用效率,改善植物的耐热和耐旱能力,将为发展耐热耐旱农业提供理论指导。本论文以玉米和模式植物拟南芥为实验材料,对玉米ZmOST1和玉米丝裂原活化蛋白激酶ZmMPK20参与植物逆境胁迫响应中的作用进行分析,阐明了它们介导植物水分散失的生理功能及分子机制。主要研究内容包括以下两个方面:1.玉米ZmOST1参与干旱胁迫响应的机制研究ABA是植物响应逆境胁迫的重要激素,并参与了植物的气孔运动的调控。拟南芥OST1在ABA调控气孔关闭信号传导中作为正调控因子起着至关重要的作用。但是由于玉米保卫细胞系统的复杂性,对ZmOST1参与植物干旱胁迫响应的机制研究较少,在本论文中,通过分子生物学、生理性状实验和电生理学对ZmOST1调控气孔运动与植物耐旱性的功能进行了分子机理研究与分析。ZmOST1在玉米根、茎、叶及保卫细胞中均有表达,在保卫细胞表达量最高,外源ABA和干旱处理都能够显著诱导ZmOST1上调表达。玉米叶肉细胞原生质体的亚细胞定位显示ZmOST1定位于细胞质和细胞核。ZmOST1的Mu转座子插入突变体在气孔运动中表现出对ABA弱敏感,膜片钳结果显示突变体中ABA不能充分激活慢性阴离子通道,突变体的离体叶片失水率高于野生型且植株整体抗干旱能力减弱,而且干旱胁迫下突变体积累较少的可溶性糖和脯氨酸。ZmOST1在ost1-1突变体的过表达株系能够部分恢复ost1-1的性状,包括ABA对慢速阴离子通道的激活增强,响应ABA诱导的气孔关闭以及干旱条件下植株整体成活率的升高。以上结果说明ZmOST1在植物体内作为ABA正调控因子,影响保卫细胞跨膜离子转运及气孔运动,进而调节植物响应干旱胁迫。2.玉米丝裂原活化蛋白激酶ZmMPK20参与高温胁迫响应的机制研究本实验室前期经过对玉米野生型B73进行EMS诱变得到高温敏感突变体1c5,在大田中突变体1c5从幼苗期就表现出高温胁迫下叶片卷曲,持续的高温胁迫导致突变体植株矮小,花粉量减少甚至不育。分析1c5表皮中表皮细胞和保卫细胞密度没有明显差异,但是1c5在高温下开放气孔的比例明显高于B73,开放的气孔使水分散失加剧,导致1c5高温下叶片失水过多而卷曲。1c5突变体与野生型B73回交得到F1代,F1自交得到F2代。F2代在大田中高温下表现出3:1（叶片未卷曲:叶片卷曲）的分离比,这表明1c5是由单基因控制性状的隐性突变体。利用重测序技术和连锁分析确定有效SNP位点位于基因 ZmZ00001d039141（Zm-B73-REFERENCE-GRAMENE-4.0）内部,导致在此位点基因编码的第307位氨基酸由脯氨酸变为亮氨酸。根据与拟南芥AtMPK20的 同 源 性 分 析,我 们 命 名 Zm00001d039141（Zm-B73-REFERENCE-GRAMENE-4.0）为 ZmMPK20。首先对ZmMPK20的基因及蛋白结构进行分析。在新测序的玉米B73的4.0版本中,玉米ZmMPK20基因是由十个外显子和九个内含子组成。基因二级结构分析表明,ZmMPK20在C端存在多个低保守性区域,在N端含有Serine/Threonine proteinkinases Domain,属于MPK亚家族。对ZmMPK20基因的启动子进行元件分析,启动子含有多个胁迫响应及激素响应元件,表明ZmMPK20可能参与植物胁迫响应。ZmMPK20蛋白具有典型的MPK的激酶结构域和“TDY”序列,属于典型MPK的D家族成员,而目前MPK的D家族成员研究报道较少。构建MPK进化树分析发现,ZmMPK20与拟南芥AtMPK20以及水稻OsMPK7/8/9/10同源性较高,在激酶结构域非常保守,表明这一结构域为蛋白行使功能所必需,在玉米、水稻和拟南芥的同源基因中第307位都位于保守结构域内且都是脯氨酸,这说明此位点极度保守,然而在突变体1c5中此位点突变为亮氨酸,是否由于点突变导致了ZmMPK20P307L功能的改变是值得研究的重要问题。对ZmMPK20在各组织表达情况进行定量分析结果发现,ZmMPK20在根、茎、叶组织中均表达,在保卫细胞中表达量高于叶中表达量,这表明ZmMPK20可能在保卫细胞中行使功能。此外,进行诱导表达模式分析实验结果发现,ZmMPK20能够被高温、ABA及干旱多种胁迫诱导,表明该基因响应多种非生物胁迫。亚细胞定位实验结果发现,ZmMPK20-GFP和ZmMPK20P307L-GFP融合蛋白都能够与线粒体定位染料MitoTraker在拟南芥叶肉细胞原生质体定位重合并表现为点状分布,这说明ZmMPK20在细胞内定位于线粒体行使功能且点突变没有影响其亚细胞定位。为了进一步分析ZmMPK20的功能,我们鉴定了拟南芥同源基因AtMPK20的T-DNA插入突变体Atmpk20,发现该突变体具有1c5相似性状:高温下叶片卷曲,活性氧积累,叶绿素含量降低,持续高温导致植株成活率降低。将ZmMPK20和ZmMPK20P307L构建载体过表达在Atmpk20突变体中发现,相对于Atmpk20突变体,ZmMPK20过表达在Atmpk20的转基因株系表现出高温下气孔开度变小,活性氧积累减少,叶绿素稳定性提高的表型,而ZmMPK20P307L过表达在Atmpk20的转基因株系并没有表现出耐热性的增强。以上结果说明ZmMPK20参与植物高温胁迫响应,调控高温下气孔的关闭以减少水分散失,增强拟南芥的耐热性。ZmMPK20P307L由于点突变很可能影响了激酶活性,无法响应高温下气孔关闭进而导致1c5高温敏感。