论文部分内容阅读
第一部分外源性BAFF对狼疮鼠Bregs/Tregs分泌IL-35的影响【目的】研究BAFF是否影响狼疮鼠脾脏中Bregs/Tregs分泌IL-35及相关机制。【方法】采用磁珠分选法分选狼疮鼠及对照鼠脾脏边缘区及滤泡区(MZ&FO)B细胞、CD4+CD25-T细胞以及CD4+CD25+Tregs;经流式细胞术、Western-blotting及real time RT-PCR分别检测不同处理组B细胞内IL-35两亚基p35、EBI3的蛋白及m RNA水平的变化并通过ELISA法检测培养上清中IL-35的分泌水平;采用流式细胞术分析产IL-35 B细胞的表型、T细胞表面BAFF受体表达情况以及不同处理组T细胞内p35、EBI3的变化;流式分选CD5+CD1dhi Fcg RIIbhi B细胞亚群并与CD4+CD25-T细胞或CD4+T细胞1:1共培养,经流式细胞术检测T细胞胞内IFN-γ、TNF-α及IL-35的表达水平。【结果】与对照鼠相比,狼疮鼠脾脏B细胞表达更高水平的IL-35,且在一定浓度范围内,外源性BAFF可促进狼疮鼠及对照鼠脾脏B细胞分泌IL-35;BAFF诱导的产IL-35的B细胞主要来源MZ B细胞亚群且具有CD5+CD1dhi Fcg RIIbhi独特的细胞表型;该群CD5+CD1dhi Fcg RIIbhi B细胞通过分泌IL-35抑制CD4+CD25-T细胞分泌炎性细胞因子IFN-γ及TNF-α,诱导CD4+CD25+Tregs增殖并促进CD4+T细胞进一步分泌IL-35从而形成正反馈环路,发挥显著的免疫抑制效应。此外,Tregs表达BAFF受体(BAFF-R及TACI)且外源性BAFF能有直接促进Tregs分泌IL-35。【结论】在狼疮鼠中,BAFF不仅是重要的致病因子,更能够在一定条件下通过诱导CD5+CD1dhiFcg RIIbhi B细胞及Tregs分泌IL-35而发挥免疫调节功能,体现了调节免疫的双面性。第二部分BAFF体外促进狼疮鼠Bregs产生IL-35的作用机制【目的】探讨BAFF诱导狼疮鼠脾脏中Bregs分泌IL-35的相关信号通路。【方法】磁珠分选法分选狼疮鼠脾脏MZ B细胞;采用BAFF受体及NF-κB通路拮抗剂处理细胞后经流式细胞术及Western-blotting检测不同处理组B细胞内p35、EBI3的蛋白水平;并经ELISA法检测不同处理组培养上清液中IL-35的分泌水平。【结果】阻断BAFF-TACI结合后,B细胞胞内p35、EBI3的表达明显下降,而阻断BAFF-BAFFR结合后p35、EBI3的表达仅轻度下降且无统计学差异。然而,封闭BAFF-R或TACI后细胞培养上清中IL-35的分泌水平均下降明显;进一步阻断胞内总NF-κB及经典的NF-κB1通路后,胞内p35、EBI3的表达以及细胞培养上清中IL-35的分泌水平均明显降低。【结论】BAFF与TACI受体结合并通过经典的NF-κB1通路促进B细胞分泌IL-35。第三部分体内验证BAFF对狼疮鼠脾脏Bregs/Tregs分泌IL-35的影响【目的】体内验证狼疮鼠脾脏中BAFF对Bregs分泌IL-35的影响及相关机制。【方法】向狼疮鼠尾静脉注射PBS或抗BAFF蛋白,10天后终止动物实验,收集10天前后狼疮鼠眼球外周血。采用ELISA法检测狼疮鼠治疗前后及不同处理组血清BAFF及IL-35的水平;流式细胞术检测并分析脾脏中产IL-35 B/T细胞的比率变化及表型;经共聚焦显微镜直接观察不同处理组脾脏组织中产IL-35 B细胞的变化。【结果】相对于对照鼠,狼疮鼠血清中BAFF及IL-35的水平均明显升高且二者呈正相关,脾脏中产IL-35的CD19+B细胞、CD4+CD25+Foxp3+Tregs、产IL-35的CD4+T细胞比率均高于对照鼠;抗BAFF治疗后狼疮鼠血清中BAFF水平明显下降,而血清IL-35的水平虽有轻度下降但无统计学差异;脾脏中产IL-35的CD19+B细胞及CD5+CD1dhiFcg RIIbhi B细胞比率均明显降低,CD4+CD25+Foxp3+Tregs、产IL-35的CD4+T细胞比率亦可见显著下降;此外,脾脏中产IL-35的B细胞具有CD21+CD23-细胞表型,与MZ B细胞的表面标志相符。【结论】实验表明BAFF可诱导MZ B细胞转化为产IL-35的CD5+CD1dhi FcγRIIbhi B细胞,而抗BAFF治疗能够明显减少产IL-35的Bregs及Tregs,解释了临床上贝利单抗治疗效果不佳的原因,揭示了BAFF在自身免疫性疾病中的新的免疫调节功能。第四部分体内验证狼疮鼠及SLE患者皮损内BAFF对IL-35的影响【目的】体内验证狼疮鼠及SLE患者皮损内BAFF、IL-35以及产IL-35的CD5+CD1dhiFcγRIIbhi B细胞的表达及其相关性。【方法】体内动物实验分为系统抗BAFF治疗(两组狼疮鼠,分别尾静脉注射PBS或抗BAFF蛋白,n=5)及局部皮损内抗BAFF治疗(两组狼疮鼠,分别耳部及背部皮损内注射PBS或抗BAFF蛋白,n=5);同时,收集25例SLE患者皮损及7例正常捐献者的正常皮肤。经免疫组织化学法检测不同处理组中皮损及正常皮肤中BAFF、EBI3、p35、CD19、CD5、CD1d及FcγRIIb的表达并采用普通显微镜进行共定位分析,采用Image Pro Plus,version 6.0软件对其表达进行定量分析后进行相关性分析。【结果】与对照组及狼疮鼠的正常皮肤相比,狼疮鼠皮损内BAFF及IL-35两亚基EBI3、p35的表达均明显升高且EBI3与p35、BAFF与EBI3、p35的表达均呈明显正相关,且同一视野内CD5、CD1d及FcγRIIb的表达均相应增加,与上述脾脏中结果相一致;尽管系统抗BAFF治疗后狼疮鼠皮损内IL-35的分泌以及产IL-35的CD5+CD1dhiFcγRIIbhi B细胞并无显著变化,但皮损内直接进行抗BAFF蛋白注射后上述指标均明显下降;此外,相对于正常人的正常皮肤,SLE患者皮损内同一视野下BAFF、EBI3、p35、CD19、CD5、CD1d及FcγRIIb的表达均明显增加,CD19+B细胞浸润增加,且EBI3与p35、BAFF与EBI3、p35的表达均呈明显正相关,表明在狼疮鼠及SLE患者皮损中BAFF均能够诱导CD5+CD1dhi FcγRIIbhi B细胞产生IL-35。【结论】与狼疮鼠脾脏中结果类似,狼疮鼠及SLE患者皮损内BAFF与产IL-35的CD5+CD1dhiFcγRIIbhi B细胞均明显增加且正相关,表明在SLE中,无论是系统免疫还是皮肤局部免疫均存在BAFF诱导CD5+CD1dhi FcγRIIbhi B细胞产生IL-35。