DMPP抑制神经胶质瘤血管发生的作用机制

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目的探究1,1-Dimethyl-4-phenyl piperazine iodide(DMPP)抑制人脑恶性神经胶质瘤U87细胞在鸡胚绒毛尿囊膜上生长的原因,以及DMPP对鸡胚早期血岛的形成、卵黄囊膜血管的发生、绒毛尿囊膜血管的发生和对血管相关生长因子的影响,初步阐明DMPP抑制神经胶质瘤血管发生的作用机制。方法鸡胚绒毛尿囊膜移植瘤模型:广泛地用于探究肿瘤组织和血管生成相关的作用,利用此模型观察DMPP对神经胶质瘤在鸡胚绒毛尿囊膜上移植瘤形成和血管发生的影响。Hematoxylin-eosin staining(H&E染色):组织结构和细胞形态染色。细胞体外培养:将人脑恶性神经胶质瘤细胞系U87细胞进行体外培养用于移植。5-Bromo-2-deoxyUridine(BrdU)标记增殖细胞:可代替胸腺嘧啶在DNA合成期(S期),活体注射或细胞培养加入,而后利用抗Brdu单克隆抗体,免疫组织化学反应显色或荧光二抗标记,显示增殖细胞。(3-4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide)MTT:细胞增殖及细胞活性的测定。Western blotting蛋白免疫印迹:将DMPP处理后U87细胞提取的蛋白样本通过聚丙烯酰胺电泳按分子量大小分离,再转移到杂交膜(blot)上,然后通过凋亡相关的一抗,以及二抗复合物对蛋白样本进行特异性检测。流式细胞仪检测细胞凋亡(PI单染色法):检测DMPP处理后U87细胞的凋亡情况。Masson染色:观察移植瘤组织中纤维的染色,并区分组织中的血管和血细胞。免疫荧光:利用FITC结合的SNA-1凝集素,标记血管内皮细胞。整体胚胎原位杂交:利用分子生物学手段,合成VE-cadherin RNA探针,用于检测胚胎内源性VE-cadherin的表达。鸡胚卵黄囊膜模型:鸡胚卵黄囊膜是一个胚体外的结构,为胚胎发育提供营养,也是血管和成血管细胞聚集和发育的最早结构位点,用于探究药物对血管生成影响的良好模型。(Reverse transcription-PCR)RT-PCR:将DMPP处理后的鸡胚尿囊膜组织裂解后提取RNA,进行RT-PCR分析血管生成相关因子的表达情况。结果DMPP能显著抑制神经胶质瘤在鸡胚绒毛尿囊膜上的生长。我们将U87神经胶质瘤细胞进行体外培养,加入DMPP后运用MTT、BudU和流式细胞仪检测相应的细胞活性、增殖和凋亡,发现DMPP并不会显著地影响U87细胞的增殖和存活。因此,我们运用了三种在体的血管发育和血管生成模型来仔细分析DMPP对血管发生的影响,包括早期鸡胚血岛模型,鸡胚卵黄囊膜模型和鸡胚绒毛尿囊膜模型,发现DMPP直接抑制胚胎发育不同阶段的血管生成。我们运用RT-PCR分析DMPP处理后的鸡胚尿囊膜血管生成因子的表达情况,发现DMPP下调了(Angiopoietin-1)Ang-1和(Hypoxia-inducible factor)HIF-2α信号的表达。结论DMPP在一定浓度范围内可以抑制神经胶质瘤在CAM上的生长,这个效应是由DMPP直接抑制血管发育和血管生成产生的。另外,DMPP下调Ang-1和HIF-2α信号的表达对抑制血管生成起着关键作用。
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