本研究室筛选到一株氧化葡萄糖酸杆菌M5(Gluconobacter oxydans M5)，该菌株能高效氧化羟乙基胺D-山梨醇生成羟乙基胺L-山梨糖，产物是糖尿病手性药物米格列醇的前提化合物，该生物催化组合化学合成技术成功开发出米格列醇合成新工艺。其中氧化葡萄糖酸杆菌的生物转化是关键，然而迄今为止，该菌种相关酶的研究鲜有报道。本课题详细研究了相关酶在细胞中的定位、组成、催化性质、基因及其催化关系，并分析了该反应相关电子传递链的组成，从而揭示了氧化葡萄糖酸杆菌高效氧化多羟基醇及其衍生物的机理。下面从四个方面简要介绍研究的主要内容。 第一，氧化葡萄糖酸杆菌M5羟乙基胺山梨醇脱氢酶在细胞中的定位、纯化、鉴定及其催化性质的研究通过超速离心机制备氧化葡萄糖酸杆菌细胞膜组分和胞质组分，分析各个组分的羟乙基胺山梨醇氧化活性，发现相关酶主要集中在膜组分中。用土温-20从细胞膜组分里溶解相应的脱氢酶，经过CM-纤维素离子层析和Sephacryl HR400凝胶层析两步分离纯化，得到电泳纯的蛋白。分子量大约80kDa，经过MALDI-TOF MS分析该蛋白质与氧化葡萄糖酸杆菌ATCC 621H(G．oxydans ATCC 621H)基因组序列推测的山梨醇脱氢酶大亚基100％吻合，与来源G．suboxydans IFO 3255的山梨醇脱氢酶基因及其氨基酸序列分别有81％和82％的同源性，表明该酶为膜结合的山梨醇脱氢酶。酶的最适反应pH和温度分别为6.0和30℃，在pH 5.0和低于30℃能够稳定存在。Pyrroloquinoline quinone(PQQ)为辅酶，镁离子或钙离子为催化必须因子。该酶能催化多种多羟基醇、糖及其衍生物和简单的仲醇。该酶具有辅酶Q-2还原酶活性，表明该依赖于PQQ的膜结合山梨醇脱氢酶通过辅酶Q连接到呼吸链。 第二，氧化葡萄糖酸杆菌膜结合山梨醇脱氢酶在细胞中对羟乙基胺山梨醇的氧化关系及其电子传递路径的研究氧化葡萄糖酸杆菌中有一系列的脱氢酶，为了研究细胞中膜结合山梨醇脱氢酶对羟乙基胺山梨醇的氧化催化关系，进行了基因的敲除和互补试验。当山梨醇脱氢酶基因缺失时，突变菌M6几乎丧失氧化羟乙基胺山梨醇的能力，当用带有山梨醇脱氢酶基因的重组质粒pBBRClMC5-sldAB互补M6时，氧化活性得以恢复，该结果表明，在氧化葡萄糖酸杆菌细胞中，膜结合山梨醇脱氢酶为氧化羟乙基胺山梨醇的主要酶源。 在细胞中，羟乙基胺山梨醇的氧化是个氧化代谢过程，即电子的传递过程，最终把电子传递给氧生成水。鉴于膜结合山梨醇脱氢酶具有辅酶Q2(Quinone)还原酶活性，生成的还原型对苯二酚(Quinol)在氧化代谢过程中会被进一步氧化成醌，实现Q的循环。为了初步鉴定下一步反应相关的酶，本试验抗霉素A、氰化钾和五氯苯酚(PCP)等抑制剂对细胞氧化羟乙基胺山梨醇耗氧活性进行分析，结果表明，在细胞中，存在氰化钾敏感性和非敏感性两种末端氧化酶，末端氧化酶为对苯二酚类氧化酶。根据以上结果，提出了氧化葡萄糖酸杆菌M5羟乙基胺山梨醇氧化代谢的电子传递链系统由山梨醇脱氢酶，辅酶Q，和两个对苯二酚氧化酶组成。该菌高效氧化羟乙基胺山梨醇的结果可能归因于这种简单的电子传递链。第三，依赖PQQ的膜结合山梨醇脱氢酶反应动力学机制的研究。 依赖POQ的山梨醇脱氢酶在细胞中氧化山梨醇生成山梨糖，该反应是山梨醇氧化代谢电子传递链的入口，是氧化代谢的关键。氧化还原酶都是双底物反应，本试验通过双底物反应初速度动力学分析，底物抑制和产物抑制试验，表明该酶具有双底物有序反应机制。电子受体为第一底物，电子供体为第二底物。用酶的动力学机制解释了实际反应中底物山梨醇和产物山梨糖抑制的现象。根据有序反应机制，推测该酶的活性中心区域除了辅酶PQQ和镁离子结合位点之外，还有两个不同的底物结合位点，一个为辅酶Q结合位点，另一个为山梨醇结合位点。 第四，氧化葡萄糖酸杆菌PQQ合成酶基因簇在大肠杆菌中单独表达合成PQQ2006年，H(o)lscher等人研究发现氧化葡萄糖酸杆菌中除了PQQ合成酶基因簇pqqABCDE之外，合成PQQ还需要tldD基因的参与。我们把氧化葡萄糖酸杆菌PQQ合成酶基因簇单独在大肠杆菌中表达，研究了其对大肠杆菌生理生长的影响，以及大肠杆菌染色体基因组合成PQQ的互补功能。结果发现，合成酶在大肠杆菌高效表达，大肠杆菌葡萄糖脱氢酶活性被激活，缩短了大肠杆菌生长的延迟时间，在细胞外及细胞内都积累大量的PQQ，最终PQQ的含量达到6mM。以上结果说明，大肠杆菌基因组能够互补基因簇pqqABCDE合成PQQ，高效表达基因簇有利于PQQ的合成。