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长链多不饱和脂肪酸（LC-PUFA）是包括人和鱼类在内的动物体的必需脂肪酸（EFA）。海水鱼的LC-PUFA合成能力大多缺乏或很弱，故其配合饲料中一般需要添加富含LC-PUFA的鱼油才能满足鱼体正常生理功能对EFA的需要；鱼油资源短缺且价格昂贵，这严重制约海水鱼养殖业的健康发展，迫切需要开发鱼油的替代物。目前认为，资源较丰富、价格较低且富含LC-PUFA前体（亚油酸和α-亚麻酸）的植物油是较理想的鱼油替代物，但要成功解决植物油替代鱼油问题，有赖于鱼类 LC-PUFA合成调控机制的阐明。本课题组近年来在黄斑蓝子鱼（Siganus canaliculatus）中首次发现和证明海水鱼具有LC-PUFA合成能力，且已从该鱼中克隆到所有LC-PUFA合成关键酶（包括?4 Fad、?6/?5 Fad、Elovl5和Elovl4）基因，这为系统深入的探讨鱼类LC-PUFA合成调控机制奠定了基础。为此，本论文拟从以下三个方面对黄斑蓝子鱼两个脂肪酸去饱和酶（?4 Fad和?6/?5 Fad）基因的转录调控机制进行较深入的研究。 一.黄斑蓝子鱼Δ6/Δ5 Fad和Δ4 Fad基因启动子功能特性研究。利用生物信息学软件对已克隆到的Δ6/Δ5 Fad和Δ4 Fad基因的启动子（分别为2044 bp和1859 bp）上的功能元件进行预测，然后对预测到的元件分别进行点突变构建突变体；利用HEK293T细胞系和萤火虫荧光素酶基因报告系统对突变体启动子的活性分别进行定量分析，最终确定NF-1、SRE、NF-Y和HNF4α等转录因子的结合元件对Δ4 Fad启动子活力重要，而C/EBP、Sp1和PPARγ等元件对Δ6 Fad启动子活力重要，它们可能参与 Fad基因的转录调控。通过光神霉素诱导处理Fad启动子，让Sp1蛋白与其元件的结合被抑制后，两个Fad的启动子活力均受到抑制。 二.Δ6/Δ5 Fad和Δ4 Fad基因启动子对LC-PUFA、Insulin应答特性的比较研究。利用EPA诱导检测实验发现，Δ4 Fad和Δ6/Δ5 Fad启动子上的 LC-PUFA应答区分别位于-723 bp到-263 bp和-456 bp到+51 bp。利用不同PUFA（LA、ALA、ARA、EPA和DHA）诱导应答区的实验发现，Δ4 Fad启动子的活性受到ARA、EPA和DHA抑制，而LA（亚油酸）、ALA（亚麻酸）对其活性无明显影响；Δ6/Δ5 Fad启动子活性受到此五种PUFA抑制。通过EPA诱导应答区功能元件发现，HNF1A、AP1和PPARγ在决定Δ6/Δ5 Fad启动子对EPA的应答反应中具有重要作用。通过Insulin诱导检测发现，Δ6/Δ5 Fad启动子的Insulin应答区域位于-456 bp到+51 bp，且HNF1A、Sp1和PPARγ在决定Δ6/Δ5 Fad启动子对Insulin的应答反应中发挥重要作用；Δ4 Fad启动子对Insulin诱导不敏感。 三. HNF4α和PPARγ在Δ6/Δ5 Fad和Δ4 Fad基因转录调控中的功能研究。为了进一步探讨转录因子HNF4α和PPARγ在?4 Fad及?6/?5 Fad基因转录调控中的作用，分别开展如下研究：（1）用HNF4α、PPARα和PPARγ的诱导剂处理转染进HEK293T细胞的Fad启动子报告基因表达载体（?4 Fad核心启动子含有HNF4α元件，?6/?5 Fad启动子含有PPARγ元件），从整体上分析结果发现，任意一种诱导药物（HNF4α激动剂Alverine、Benfluorex和抑制剂BI6015，PPARα激动剂Wy14643和PPARγ激动剂Troglitazone）对Δ4 Fad和Δ6/Δ5 Fad启动子活力的调节作用相反。（2）利用诱导剂处理黄斑蓝子鱼的原代肝细胞后，PPARα和PPARγ的激动剂可显著增加PPARγ的表达，降低Δ6/Δ5 Fad基因的表达，对Δ4 Fad基因的表达也有下调作用，但不显著；PPARα激动剂对PPARα基因的表达无影响，HNF4α的三种诱导剂对HNF4α、Δ4 Fad和Δ6/Δ5 Fad基因的表达也没有显著影响。（3）通过构建pcDNA3.1+HNF4α过表达载体及过表达实验发现， HNF4α过表达可提高Δ4 Fad启动子的活力，降低Δ6/Δ5 Fad启动子的活力。（4）在黄斑蓝子鱼原代肝细胞中过表达HNF4αmRNA后，Δ6/Δ5 Fad和Δ4 Fad基因的表达水平显著提高，但原代肝细胞的脂肪酸组成不受影响，说明HNF4α对Δ4 Fad和Δ6/Δ5 Fad的调节作用可能发生在转录水平。 总之，本研究确定了Δ4 Fad和Δ6/Δ5 Fad基因启动子上重要的转录因子结合位点及其PUFA和Insulin的应答区，并鉴定出Δ6/Δ5 Fad基因启动子上PUFA和Insulin应答区的应答元件。Sp1元件在决定Fad启动子活力、Insulin应答方面起着重要作用。PPARγ和HNF4α分别是Fad基因表达负调控因子和正调控因子。这是首次在脊椎动物中报道Δ4 Fad基因的启动子结构和功能特性，首次在海洋鱼类中报道Δ6/Δ5 Fad基因启动子结构，也是首次在脊椎动物中发现HNF4α是Fad基因的转录因子。研究成果可为全面揭示鱼类LC-PUFA合成调控机制增加新的内容，为研发提高鱼体内源性LC-PUFA合成能力的方法提供基础。