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研究目的:在中枢神经系统中,神经干细胞(Neural Stem Cell,NSC)可以定向分化为少突胶质前体细胞(Oligodendrocyte Precursor Cell,OPC),再进一步分化为形成髓鞘的成熟的少突胶质细胞,起到支撑并包裹神经轴突的作用。其中发育时期的OPC在少突胶质细胞成熟并髓鞘化过程中非常重要,而成年的OPC同样在髓鞘损伤后修复的过程中扮演了关键的角色,因此明确OPC分化的调控网络可以为以OPC为靶细胞治疗脱髓鞘疾病的策略提供理论基础,以及为该策略指导下的特异性药物开发研究方向。近年来的研究表明,表观遗传修饰在细胞的命运决定、细胞的增殖分化过程中均扮演了重要的角色。其中,ATP依赖的染色质重塑家族SWI/SNF复合物组分Brg1在小鼠神经发育过程中非常重要。Brg1可以通过结合Olig2启动子来调控NSC向pri-OPC的定向转化过程,在pri-OPC阶段敲除Brg1可引起严重的髓鞘形成障碍,而在晚期OPC中敲除Brg1对少突胶质细胞分化成熟无明显影响。故Brg1对OPC分化,尤其是PDGFRα+早期OPC分化过程中的作用仍未清晰。此外,OPC中的Brg1在髓鞘损伤后再生过程中的作用也未明确。在此基础之上,本研究欲深入探讨染色质重塑因子Brg1在PDGFRα+早期OPC和CNP+晚期OPC分化过程中的调控作用,同时明确成年OPC中的Brg1对髓鞘损伤后再生过程的影响,并探索Brg1调控OPC分化的具体分子机制。研究方法:1 Brg1调控PDGFRα+OPC分化及再生的作用研究1.1 Brg1特异性调控PDGFRα+早期OPC的分化成熟(1)通过少突胶质细胞的单细胞转录组数据库等分析明确OPC的早期标志物PDGFRα和晚期标志物CNP。(2)构建CNP+晚期OPC中特异性敲除Brg1小鼠(Brg1 cKO),采用原位杂交实验考察脊髓中少突胶质细胞的分化成熟情况。(3)构建PDGFRα+早期OPC中特异性敲除Brg1小鼠(Brg1 iKO),采用免疫荧光实验检测大脑和脊髓中少突胶质细胞的分化成熟情况,采用透射电镜实验检测Brg1 iKO小鼠大脑和脊髓中的髓鞘形成情况。(4)采用免疫荧光实验考察PDGFRα+早期OPC中敲除Brg1对细胞增殖、细胞死亡、星形胶质细胞和小胶质细胞活化的影响。1.2 PDGFRα+OPC中Brg1调控髓鞘损伤后再修复的过程(1)通过脊髓损伤的转录组数据库分析Smarca4/Brg1在脊髓损伤中的动态表达;(2)构建LPC诱导的脊髓髓鞘损伤模型,采用免疫荧光实验检测Brg1蛋白在髓鞘损伤后的变化情况,以及损伤区域Brg1在少突胶质细胞中的表达情况。(3)采用Control和Brg1 iKO成年小鼠构建LPC损伤模型,采用原位杂交实验、免疫荧光实验和透射电镜实验考察OPC中Brg1的缺失对髓鞘损伤后OPC的再生及再髓鞘化的影响。采用原位杂交实验检测OPC中敲除Brg1后PDGFRα蛋白的表达,考察Brg1对OPC再增殖能力的影响。2 Brg1调控PDGFRα+OPC分化的分子机制研究2.1 Brg1通过调控H3K27me3的表达来促进OPC的分化(1)采用流式细胞分选技术分离提纯Control OPCs和Brg1敲除的OPCs,并送ATAC-seq和RNA-seq测序分析。(2)分析比较NSC和OPC的ATAC-seq数据,考察Smarca4/Brg1的染色质开放程度;将OPC的ATAC-seq数据和Brg1在OPC中的Chip-seq数据进行结合分析,寻找Brg1可能的调控网络。(3)采用GSEA分析少突胶质细胞分化相关基因的富集情况,进而qPCR、细胞染色实验考察在OPC敲除或抑制Brg1后少突胶质细胞标志物的变化。(4)RNA-seq分析找到H3K27me3相关通路变化,qPCR、细胞染色实验验证OPC敲除或抑制Brg1后H3K27me3表达的变化。(5)采用ATAC-seq结合Chip-seq数据分析明确Brg1对H3K27me3的直接调控作用。(6)采用荧光染色考察体外OPC中抑制H3K27me3对OPC分化的影响。2.2 Brg1通过特异性调控少突胶质细胞、干细胞特性和神经元相关转录因子的激活来促进OPC分化(1)分析比较Contro1和Brg1敲除的OPC的ATAC-seq数据,考察少突胶质细胞分化相关基因的染色质开放情况。(2)采用Motif分析寻找Contro1和Brg1敲除的OPC中特异性Motif及转录因子。(3)通过分析ATAC-seq数据和Chip-seq数据考察OPC中Brg1能否结合少突胶质细胞相关转录因子调控少突胶质细胞分化相关基因的染色质开放。(4)将Brg1缺失的OPC中特异性Motif预测的转录因子与Brg1缺失的OPC中上调的差异基因结合分析,找到特异性上调的干细胞特性和神经元相关转录因子。(5)RNA-seq分析干细胞标志物和神经元标志物相关基因和通路的变化情况。(6)在OPC中过表达干细胞相关转录因子,qPCR考察OPC分化相关基因的变化。研究结果:1 Brg1调控PDGFRα+OPC分化及再生的作用研究1.1 Brg1特异性调控PDGFRα+早期OPC的分化成熟(1)通过少突胶质细胞的单细胞转录组数据库分析得到,OPC可以分为不同的阶段,其中Pdgfra主要在早期OPC中表达,Cnp主要在晚期OPC中表达,Pdgfra和Cnp基因在OPC中不同的表达模式提示其可以成为OPC不同阶段的标志物。(2)通过转基因手段在CNP+OPC中特异性敲除Brg1,原位杂交实验结果表明,在CNP+OPC中敲除Brg1对OPC分化无明显影响。(3)通过转基因手段在PDGFRα+OPC中特异性敲除Brg1,免疫荧光及电镜结果显示,Brg1 iKO小鼠大脑中OPC的分化发育及髓鞘形成受到明显的抑制。免疫荧光及透射电镜结果显示,在Brg1 iKO小鼠脊髓中OPC的分化发育及髓鞘形成同样有明显的抑制作用,但是弱于大脑中的作用。(4)荧光染色结果表明,PDGFRα+早期OPC中Brg1调控OPC分化的作用是通过细胞自发产生的,不受到星形胶质细胞和小胶质细胞等外界的干扰。综上可推断,Brg1可以选择性地调控PDGFRα+早期OPC的分化成熟,而对CNP+晚期OPC分化的调控作用较弱,提示Brg1对OPC的调控作用具有阶段特异性。1.2 PDGFRα,+OPC中Brg1调控髓鞘损伤后再修复的过程(1)通过2013年Kenian Chen报道的脊髓损伤的RNA-seq数据分析表明,Smarca4/Brg1的表达在脊髓损伤修复的过程中呈现出动态的变化。(2)免疫荧光结果显示,在LPC诱导的脊髓髓鞘损伤模型中,OPC中的Brg1表达明显增多,提示Brg1可能在髓鞘再生过程中发挥一定的作用。(3)采用Control和Brg1 iKO成年小鼠构建LPC髓鞘损伤模型,原位杂交实验、免疫荧光实验和透射电镜实验结果表明,在Brg1 iKO小鼠的髓鞘损伤区域,OPC的再分化被显著抑制,髓鞘再生也明显减少,而Pdgfra的表达无明显变化,提示OPC中的Brg1 可以调控PDGFRα+OPC的分化过程,从而促进损伤后的髓鞘再生。2 Brg1调控PDGFRα+OPC分化的分子机制研究2.1 Brg1通过调控H3K27me3的表达来促进OPC的分化(1)通过流式细胞分选技术分别得到PDGFRα+Tomato+的Control和Brg1敲除的OPC样本,并进行ATAC-seq和RNA-seq测序分析。(2)首先通过对ATAC-seq数据分析发现Brg1在NSC和OPC中的染色质结构都是开放的,表明转录因子容易结合到Brg1基因的染色质上,从而促进转录发生。此外,通过结合OPC的ATAC-seq和Brg1的Chip-seq数据分析发现,在OPC中与Brg1结合的染色质开放的基因富集在一些细胞增殖分化等相关的GO基因集中。随后针对RNA-seq的GSEA分析结果也显示Brg1参与到细胞分化相关通路中。以上结果均提示OPC中的Brg1参与细胞分化成熟相关的调控网络。(3)采用GSEA分析发现OPC中敲除Brg1抑制OPC分化通路,同时激活负性调控因子Wnt信号通路;进而qPCR、细胞染色实验也表明在OPC敲除或抑制Brg1后少突胶质细胞标志物降低,提示Brg1调控OPC分化相关基因的表达。(4)RNA-seq分析发现敲除Brg1抑制H3K27me3相关通路表达,qPCR、细胞染色实验验证OPC敲除或抑制Brg1后H3K27me3表达降低。(5)采用ATAC-seq结合Chip-seq数据分析发现Brg1通过结合并调控PRC2复合物的表达调控H3K27me3的表达。(6)荧光染色结果表明,体外OPC中减少H3K27me3表达可以抑制OPC分化基因的表达。综上所述,Brg1可以通过调控H3K27me3的表达来促进OPC的分化。2.2 Brg1通过特异性调控少突胶质细胞、干细胞特性和神经元相关转录因子的激活来促进OPC分化(1)分析比较Control和Brg1敲除的OPC的ATAC-seq和Chip-seq数据,发现Brg1可以结合到相关基因的启动子/增强子区域。(2)采用Motif分析找到Control和Brg1敲除的OPC中特异性Motif及转录因子,在Control OPC中主要为少突胶质细胞相关转录因子,而在Brg1敲除的OPC中主要为干细胞特性和神经元相关的转录因子。(3)通过分析ATAC-seq数据和Chip-seq数据,发现在Brg1存在时,Brg1通过结合OPC相关转录因子(Olig2,Sox10)来直接调控OPC分化基因的表达,从而促进OPC分化。(4)当Brg1缺失时,干细胞特性相关转录因子(Klf4,Sox2,Sox4)和神经元相关转录因子(Cux1,Pbx1)的表达增加,进而促进干细胞和神经元标志物基因的表达,从而抑制OPC分化。(5)RNA-seq分析显示OPC中敲除Brg1后干细胞标志物和神经元标志物相关基因和通路明显上调。(6)在Oli-neu中过表达干细胞相关转录因子K1f4,qPCR实验结果显示过表达K1f4抑制OPC分化相关基因的表达。综上所述,Brg1可以通过特异性调控少突胶质细胞、干细胞特性和神经元相关转录因子的激活来促进OPC分化。研究结论:本研究发现,Brg1对OPC分化的调控具有阶段特异性,特别是对PDGFRα+早期OPC的分化过程具有较强的调控作用,而对于CNP+晚期OPC的分化过程则无明显影响。其次,在髓鞘损伤后的修复过程中,损伤区域的OPC中的Brg1同样能调控其再分化并促进髓鞘再生。另外,Brg1可以通过两部分作用来调控OPC分化,一是通过调控H3K27me3的表达来促进OPC的分化;二是通过特异性调控少突胶质细胞、干细胞特性和神经元相关转录因子的激活来促进OPC分化。我们的发现不仅能完善Brg1的调控网络,也丰富了SWI/SNF染色质重塑复合物调控少突胶质细胞分化发育及再生过程中的分子机制,阐明Smarca4突变的Coffin-Siris综合征患者出现白质缺陷的可能机理,并为其治疗提供了一定的研究基础。