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冠状动脉微栓塞（Coronary Microembolization,CME）是冠心病介入治疗（Percutaneous Coronary Intervention,PCI）的主要并发症之一。CME可导致术中即刻或术后持续的冠脉“慢血流”或“无血流”状态,进而造成微循环功能障碍、冠脉血流储备减少、心肌损伤、心肌收缩功能减退等严重后果,是患者远期预后不良和主要心血管不良事件发生率上升的重要原因。目前对于CME的防治尚无有效方法,因此,研究CME致心肌损伤的内在机制对其防治具有重要意义。细胞焦亡（Pyroptosis）是一种由炎症小体介导的炎性程序性死亡,是近年来的研究热点之一。其中,NLRP3炎症小体介导的焦亡在众多心血管疾病的发生发展中起到了关键作用。我们前期研究表明心肌局部炎症损伤是引起CME后心肌损伤的关键因素,进而发现NLRP3炎症小体在CME心肌组织中显著激活,抑制NLRP3炎症小体的激活可以减轻CME所致的心肌损伤并改善心功能。因此,NLRP3炎症小体介导的细胞焦亡可能成为CME防治的潜在靶点,但其具体分子调控机制尚不清楚。长链非编码RNA（Long non-coding RNA,lncRNA）是长度在200-100000nt之间且无编码蛋白能力的一类长链RNA,其可通过与蛋白质相互作用、作为“分子海绵”吸附mircoRNA、调控mRNA剪切、调节染色质重塑、与转录因子或DNA相互作用调控转录等作用机制参与炎症、凋亡、自噬、细胞生长发育等多种病理生理过程。越来越多研究证实,lncRNA广泛参与了心肌梗死、心肌缺血再灌注损伤、心肌肥厚、心肌重构、心脏老化等心血管疾病的调控。但目前关于lncRNA在CME致心肌损伤过程中所起作用及机制的研究鲜有报道。我们前期在对大鼠CME模型心肌组织的lncRNA芯片检测中发现lncRNA TUG1表达下调,但lncRNA TUG1是否参与调控了CME引起的心肌损伤尚未见报道。本课题通过构建大鼠CME体内实验模型和H9C2心肌细胞炎症损伤体外模型,运用生物信息学、分子生物学和组织学研究方法,首次在器官、细胞、分子水平探讨了lncRNA TUG1在CME致心肌损伤过程中所起的作用及其调控机制,以期更深入理解CME的发生发展机制,为CME的防治提供新思路及新靶点。第一部分lncRNA TUG1在冠状动脉微栓塞心肌组织中的动态表达变化及其与心功能损伤和细胞焦亡的关系目的:建立大鼠CME模型,观察CME大鼠心肌组织lncRNA TUG1的动态变化情况及其与心功能损伤和心肌组织细胞焦亡的关系。方法:50只SD大鼠随机分为假手术组（Sham组,n=10）和冠状动脉微栓塞组（CME组,n=40）,其中CME组大鼠随机分为CME后3h,6h,9h,12h观察时间点组,每组均为10只。夹闭升主动脉的同时经左心室注射聚酯微球建立动物模型,Sham组则注射等体积生理盐水。HE染色用于观察心肌组织病理改变,透射电镜用于观察心肌组织超微结构,心脏彩超检测大鼠心功能,qRT-PCR用于检测lncRNA TUG1、NLRP3 mRNA、IL-1βmRNA和IL-18 mRNA的相对表达量,Western blot用于检测NLRP3、IL-1β和IL-18蛋白相对表达量。结果:1.CME大鼠模型建立成功。CME心肌组织HE染色可观察到微栓子,微栓子周围可见间质水肿,心肌纤维排列紊乱甚至溶解以及大量炎症细胞浸润。透射电镜可观察到CME后心肌纤维排列紊乱且部分断裂,Z线不齐,线粒体肿胀及空泡化,线粒体嵴紊乱、显示不清。2.与Sham组相比,CME后各时间点（3h,6h,9h,12h）观察组LVEF和LVFS均显著降低,且均在CME 9h后达最低值（均P＜0.05）。3.与Sham组相比,CME后各时间点（3h,6h,9h,12h）观察组心肌组织lncRNA TUG1相对表达量均显著下调,其表达量在CME 9h后达最低值（P＜0.05）;与Sham组相比,NLRP3 mRNA、IL-1βmRNA、IL-18 mRNA的相对表达量均显著上调,且其表达量均在CME 9h后达最高值（均P＜0.05）。4.与Sham组相比,CME后各时间点（3h,6h,9h,12h）观察组心肌组织NLRP3、IL-1β和IL-18蛋白相对表达量均显著上调,且其表达量均在CME 9h后达最高值（均P＜0.05）。5.lncRNA TUG1表达与LVEF呈正相关,而与NLRP3 mRNA、IL-1βmRNA和IL-18 mRNA的表达呈负相关（均P＜0.05）。结论:大鼠CME模型成功建立。CME心肌组织中lncRNA TUG1表达水平显著下调,其可能与CME引起的心功能损害和心肌组织细胞焦亡密切相关。第二部分lncRNA TUG1对冠状动脉微栓塞后心肌损伤和细胞焦亡影响的研究目的:探索lncRNA TUG1在CME引起的心肌损伤和细胞焦亡中所起的作用。方法:60只SD大鼠随机分为假手术组（Sham组）、冠状动脉微栓塞组（CME组）、CME+Ad-NC组、CME+Ad-TUG1组、CME+Ad-sh NC组、CME+Ad-sh TUG1组,每组均为10只。夹闭升主动脉的同时经左心室注射聚酯微球建立CME模型,Sham组则注射等体积生理盐水。CME+Ad-NC组、CME+Ad-TUG1组、CME+Ad-sh NC组、CME+Ad-sh TUG1组于造模前3周分别由尾静脉注射TUG1过表达对照、TUG1过表达、TUG1干扰对照、TUG1干扰腺相关病毒。应用荧光显微镜观察病毒转染情况,心脏彩超检测心功能,HBFP染色观察心肌微栓塞区域并计算面积,ELISA法测定血清cTnI浓度,qRT-PCR检测心肌组织lncRNA TUG1相对表达量,Western blot检测焦亡相关蛋白（NLRP3、ASC、Caspase-1 p20、GSDMD、IL-1β、IL-18）相对表达量。结果:1.荧光显微镜下可观察到腺相关病毒转染成功的心肌组织发出绿色荧光。与CME+Ad-NC组比较,CME+Ad-TUG1组心肌组织lncRNA TUG1表达水平明显上调（P＜0.05）;与CME+Ad-sh NC组比较,CME+Ad-sh TUG1组心肌组织lncRNA TUG1表达水平明显下调（P＜0.05）。2.与Sham组比较,CME组LVEF和LVFS显著下降（均P＜0.05）,过表达lncRNA TUG1可显著提升CME大鼠的LVEF和LVFS（均P＜0.05）,而干扰lncRNA TUG1表达则进一步降低CME大鼠的LVEF和LVFS（均P＜0.05）。3.与Sham组比较,CME组心肌微梗死面积明显增加（P＜0.05）;过表达lncRNA TUG1可显著减小CME后心肌微梗死面积（P＜0.05）,而干扰lncRNA TUG1会更进一步增加CME微梗死面积（P＜0.05）。4.与Sham组比较,CME组血清cTnI水平明显增加（P＜0.05）;过表达lncRNA TUG1可显著降低CME后血清cTnI水平（P＜0.05）,而干扰lncRNA TUG1会更进一步增加血清cTnI水平（P＜0.05）。5.与Sham组比较,CME组心肌组织焦亡相关蛋白表达水平显著上调（P＜0.05）;过表达lncRNA TUG1可显著下调CME后心肌组织焦亡相关蛋白表达水平（P＜0.05）,而干扰lncRNA TUG1会更进一步增加心肌组织焦亡相关蛋白表达水平（P＜0.05）。结论:过表达lncRNA TUG1可减轻CME后心肌损伤和心肌组织细胞焦亡,而干扰lncRNA TUG1表达则进一步加重CME后心肌损伤和心肌组织细胞焦亡。第三部分lncRNA TUG1通过吸附miR-186-5p调控冠状动脉微栓塞后心肌细胞焦亡的研究目的:研究lncRNA TUG1调控CME后心肌损伤和细胞焦亡的具体分子机制。方法:夹闭升主动脉的同时经左心室注射聚酯微球建立大鼠CME模型,LPS刺激H9C2细胞建立体外心肌细胞炎性损伤模型。TUG1过表达和TUG1shRNA腺相关病毒或质粒以及miR-186-5p agomiR和antagomiR被用于大鼠和H9C2细胞TUG1和miR-186-5p的过表达和敲减。运用荧光原位杂交（FISH）实验观察TUG1细胞内定位,双荧光素酶报告基因检测、anti-AGO2RIP、RNA Pull-down被用于检测TUG1与miR-186-5p的直接结合能力,心脏彩超检测心功能,HBFP染色观察心肌微栓塞区域并计算面积,ELISA法测定血清cTnI和细胞培养上清液cTnI、IL-1β、IL-18浓度,qRT-PCR检测心肌组织lncRNA TUG1和miR-186-5p相的对表达量,Western blot检测组织细胞焦亡相关蛋白（NLRP3、ASC、Caspase-1 p20、GSDMD、IL-1β、IL-18）的相对表达量。结果:1.FISH定位显示lncRNA TUG1主要在心肌细胞胞浆表达。双荧光素酶报告基因检测、anti-AGO2 RIP和RNA Pull-down检测结果表明,lncRNA TUG1和miR-186-5p可在心肌组织细胞内互相结合。2.与Sham组相比,CME后各时间点（3h,6h,9h,12h）观察组心肌组织miR-186-5p表达量均显著上调,其表达量于CME 9h后达最高值（均P＜0.05）。且miR-186-5p的表达与lncRNA TUG1的表达呈负相关（P＜0.05）。3.miR-186-5p antagomiR和agomiR可在大鼠心肌组织成功敲减和过表达miR-186-5p（均P＜0.05）。敲减miR-186-5p使心肌组织TUG1表达量显著增加,而过表达miR-186-5p则使TUG1表达量显著降低（均P＜0.05）;过表达TUG1可使心肌组织miR-186-5p表达明显下调,而干扰TUG1表达则使miR-186-5p表达明显上调（均P＜0.05）。4.敲减miR-186-5p可改善CME后心功能损伤,表现为LVFE和LVFS显著增加（均P＜0.05）;敲减miR-186-5p可显著减小CME后心肌微梗死面积（P＜0.05）;敲减miR-186-5p使CME后血清cTnI水平明显降低（P＜0.05）;敲减miR-186-5p可使CME后心肌组织NLRP3、ASC、Caspase-1p20、GSDMD、IL-1β、IL-18蛋白表达量明显下降（均P＜0.05）。5.体外回复实验（rescue experiment）结果显示:与normal组相比,LPS+blank组心肌细胞生存率明显降低,细胞培养上清液心肌损伤标志物cTnI和LDH水平显著升高,细胞培养上清液炎症因子IL-1β和IL-18漏出明显增加,心肌细胞焦亡相关蛋白表达水平显著升高（均P＜0.05）;与LPS+NC组相比,LPS+TUG1组心肌细胞生存率明显升高,上清液cTnI和LDH水平明显降低,上清液IL-1β和IL-18漏出明显减少,心肌细胞焦亡相关蛋白表达水平明显降低（均P＜0.05）;与LPS+TUG1+ago-NC组相比,LPS+TUG1+ago-186组心肌细胞生存率明显降低,上清液cTnI和LDH水平明显升高,上清液IL-1β和IL-18漏出明显增加,心肌细胞焦亡相关蛋白表达水平明显升高（均P＜0.05）。结论:1.抑制miR-186-5p可减轻CME后心肌损伤和细胞焦亡。2.lncRNA TUG1可通过吸附miR-186-5p缓解CME后心肌损伤和细胞焦亡。第四部分miR-186-5p靶向XIAP调控冠状动脉微栓塞后心肌细胞焦亡的研究目的:本研究旨在探索miR-186-5p调控CME后心肌损伤和细胞焦亡的具体分子机制。方法:夹闭升主动脉的同时经左心室注射聚酯微球建立大鼠CME模型,LPS刺激H9C2细胞建立体外心肌细胞炎性损伤模型。XIAP过表达和XIAP shRNA腺相关病毒或质粒以及miR-186-5p agomiR和antagomiR被用于大鼠和H9C2细胞XIAP和miR-186-5p的过表达和敲减。运用双荧光素酶报告基因和RNA Pull-down技术检测miR-186-5p与XIAP mRNA的结合能力,心脏彩超检测心功能,HBFP染色观察心肌微栓塞区域并计算面积,ELISA法测定血清cTnI和细胞培养上清液cTnI、IL-1β、IL-18浓度,qRT-PCR检测心肌组织miR-186-5p和XIAP mRNA的相对表达量,Western Blot检测XIAP蛋白和焦亡相关蛋白（NLRP3、ASC、Caspase-1 p20、GSDMD、IL-1β、IL-18）的相对表达量。结果:1.双荧光素酶报告基因检测和RNA Pull-down检测结果表明,miR-186-5p和XIAP mRNA在心肌组织细胞内能互相结合。2.与Sham组相比,CME后各时间点（3h,6h,9h,12h）观察组心肌组织XIAP mRNA和蛋白的表达量均显著下调,其表达量于CME 9h后达最低值（均P＜0.05）。且XIAP mRNA的表达与miR-186-5p的表达呈负相关（P＜0.05）,而与lncRNA TUG1的表达呈正相关（P＜0.05）。3.XIAP过表达和shRNA腺相关病毒可在大鼠心肌组织成功过表达和干扰XIAP（均P＜0.05）。敲减miR-186-5p使心肌组织XIAP mRNA表达量显著增加,而过表达miR-186-5p则使XIAP mRNA表达量显著降低（均P＜0.05）;过表达XIAP可使心肌组织miR-186-5p表达明显下调,而干扰XIAP表达则使miR-186-5p表达明显上调（均P＜0.05）。4.过表达XIAP可改善CME后心功能损伤,表现为LVFE和LVFS显著增加（均P＜0.05）;过表达XIAP可显著减小CME后心肌微梗死面积（P＜0.05）;过表达XIAP使CME后血清cTnI水平明显降低（P＜0.05）;过表达XIAP可使CME后心肌组织NLRP3、ASC、Caspase-1 p20、GSDMD、IL-1β、IL-18蛋白表达量明显下降（均P＜0.05）。5.体外回复实验（rescue experiment）结果显示:与normal组相比,LPS+blank组心肌细胞生存率明显降低,细胞培养上清液心肌损伤标志物cTnI和LDH水平显著升高,细胞培养上清液炎症因子IL-1β和IL-18漏出明显增加,心肌细胞焦亡相关蛋白表达水平显著升高（均P＜0.05）;与LPS+anta-NC组相比,LPS+anta-186组心肌细胞生存率明显升高,上清液cTnI和LDH水平明显降低,上清液IL-1β和IL-18漏出明显减少,心肌细胞焦亡相关蛋白表达水平明显降低（均P＜0.05）;与LPS+anta-186+sh NC组相比,LPS+anta-186+sh XIAP组心肌细胞生存率明显降低,上清液cTnI和LDH水平明显升高,上清液IL-1β和IL-18漏出明显增加,心肌细胞焦亡相关蛋白表达水平明显升高（均P＜0.05）。结论:1.过表达XIAP可减轻CME后心肌损伤和细胞焦亡。2.miR-186-5p可靶向XIAP加重CME后心肌损伤和细胞焦亡。