研究背景目前研究认为,高血压的发病机制涉及多个系统。脂肪组织作为重要的内分泌器官,所分泌的脂肪细胞因子如脂联素、瘦素以及生物活性物质如脂肪酸、前列腺素、血管紧张素原等,在心血管疾病的发生发展中起到了重要作用。脂肪细胞因子的表达以及功能失调,被认为是导致高血压发病的重要原因。在众多的脂肪细胞因子中,脂联素的作用尤其引人注目。脂联素与高血压的关系不仅得到临床结果的佐证,也得到实验动物结果的支持。临床研究发现血浆脂联素水平的改变与高血压密切相关。脂联素敲除小鼠在高盐诱导下表现为血压升高,利用腺病毒过表达脂联素可以降低肥胖小鼠的血压。尿钠重吸收增加,排泄受损是高血压发病中的重要部分,但是脂联素的肾脏作用、参与高血压发生的机制等尚不清楚。脂联素受体分为两个亚型:脂联素受体1(Adipo R1)以及脂联素受体2(Adipo R2)。Adipo R1和Adipo R2在全身广泛分布。研究显示脂联素的两个受体亚型在肾脏均有高表达,并且脂联素通过肾脏脂联素受体对肾脏的生理和病理调节起到了重要作用。我们初期研究也发现脂联素受体在RPT细胞中的表达;肾脏灌注脂联素发挥促尿钠排泄作用,但高血压状态下该作用受损。脂联素受体虽不属于G蛋白偶联受体(G protein coupled receptors,GPCRs),但是却能被G蛋白偶联受体激酶(G protein coupled receptors kinases,GRKs)所磷酸化,其受体磷酸化是其功能改变的重要机制之一;既往的研究发现,在众多的GRK亚型中,GRK4活性增高早于高血压发生而出现,其在高血压中的作用受到人们关注。GRK4基因位于人类染色体4q16.3的位置,与原发性高血压相关。GRK4变异体出现的机率与血压增高程度明显相关。利用GRK4变异体对非洲加纳人原发性高血压的预测准确率达70%以上,而对日本人原发性高血压的预测准确率达94%。我们对多个研究中心的研究结果所做的Meta分析也显示GRK4变异体与高血压发生的关系密切。GRK4变异体三个转基因小鼠均表现为高血压,GRK4?142V小鼠为显性高血压,A486和R65L小鼠在高盐负荷的情况下表现为盐敏感性高血压。以此我们推测GRK4有可能参与了肾脏脂联素受体的磷酸化,从而参与了高血压的进展。所以,针对性抑制肾脏GRK4的表达可作为增强尿钠排泄,从而改善高血压的有效尝试。综上所述,我们推测:脂联素具有利尿排钠作用,该作用在高血压状态下丧失;其丧失的原因归因于脂联素受体发生磷酸化导致受体失活,归因于肾脏GRK4表达和活性增高;抑制肾脏GRK4具有降血压作用。研究目的研究脂联素对肾脏利尿排钠的影响及在高血压发生发展中的作用。明确GRK4是否参与调控脂联素受体磷酸化从而对血压进行调节,超声微泡靶向沉默肾脏GRK4是否对SHR大鼠的血压和尿钠产生影响。研究内容和方法1.脂联素在肾脏尿钠排泄中的作用及其机制1.1采用免疫印迹以及免疫荧光染色的方法,观察脂联素2种受体Adipo R1和Adipo R2,在正常血压大鼠(Wista Kyoto rat,WKY)肾脏及RPT细胞上的表达。1.2利用WKY大鼠,通过单肾灌注不同浓度的脂联素,观察尿流量、尿钠排泄率、以及血压的变化以明确脂联素是否具有利尿作用。同时采用高温灭活脂联素蛋白活性的方法,以排除蛋白的渗透性利尿作用以及致敏作用。1.3在WKY的RPT细胞上,采用Na+-K+-ATP酶活性检测方法,观察脂联素作用不同浓度和时间后对Na+-K+-ATP酶活性的影响。1.4实验首先验证Adipo R1和Adipo R2的小干扰RNA(si RNA)的干扰效率,然后将Adipo R1和Adipo R2的si RNA转染至RPT细胞中,观察在脂联素受体受到抑制时,脂联素对Na+-K+-ATP酶的作用,以明确何种受体介导脂联素的作用。1.5采用Na+-K+-ATP酶活性测定技术,加入磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶(Adenosine 5‘-monophosphate-activated protein kinase,AMPK)抑制剂Compound C、一氧化氮合酶(Endothelial nitric oxide synthase,e NOS)抑制剂(NG-nitro-l-arginine methyl ester,L-NAME)初步筛选脂联素抑制Na+-K+-ATP酶活性的信号通路。然后,采用免疫印迹法进一步观察在脂联素作用后,磷酸化AMPK及其下游信号分子e NOS的磷酸化表达情况。2.脂联素受体表达下调及GRK4调控脂联素受体磷酸化导致脂联素促尿钠排泄作用受损2.1采用同WKY大鼠相同浓度梯度的脂联素,对SHR进行单肾灌注。观察尿流量、尿钠排泄率以及平均动脉压的改变。2.2采用自发性高血压大鼠(Spontaneous hypertensive rat,SHR)的RPT细胞,观察脂联素对Na+-K+-ATP酶的作用。2.3采用实时定量PCR观察,比较于WKY RPT细胞,脂联素两个受体基因在SHR RPT细胞上的表达情况,同时,免疫印迹方法检测脂联素受体的蛋白表达情况。2.4单肾灌注脂联素受体激动剂即小分子化合物Adipo Ron对SHR尿钠排泄影响,以进一步明确受损的脂联素利尿作用来源于脂联素受体的改变。2.5根据实验结果,设计脂联素两个受体的过表达质粒,提取质粒并在SHR的RPT细胞上转染,观察脂联素受体恢复表达后,脂联素对Na+-K+-ATP酶的作用。2.6利用免疫共沉淀的方法,观察在SHR的RPT细胞上,脂联素受体的磷酸化表达情况。2.7脂联素受体激动剂Adipo Ron灌注GRK4?142V转基因小鼠(相比较于GRK4?WT小鼠,该小鼠的GRK4活性增强),观察脂联素受体参与的利尿作用是否受损。2.8筛选有效的GRK4 si RNA。观察在SHR RPT细胞中,干扰GRK4表达后,脂联素受体磷酸化程度。3.GRK4超声微泡靶向治疗改善SHR脂联素受体磷酸化并调节尿钠排泄与血压3.1利用5-羧基荧光素(5-Carboxyfluorescein,FAM)标记的超声微泡对GRK4si RNA进行包裹。3.2将超声微泡注射到SHR,在肾脏进行超声微泡靶向破坏技术(Ultrasound-targeted microbubble destruction,UTMD)释放出GRK4 si RNA。20天后,观察SHR血压以及24小时(hour,h)尿量、尿钠排泄率,以及肾功能指标和肾纤维化指标。3.3取UTMD传输GRK4 si RNA至SHR大鼠肾脏,采用免疫共沉淀方法,观察脂联素受体磷酸化情况。研究结果1.脂联素受体Adipo R1以及Adipo R2在肾脏近曲小管均有表达,特别是肾脏皮质,在RPT细胞表达丰富。Adipo R1的蛋白条带为43Kd,Adipo R2的蛋白条带为44Kd。2.脂联素对WKY大鼠具有促尿量和尿钠排泄的作用,该作用呈现浓度依赖性3.脂联素对WKY RPT细胞上的Na+-K+-ATP酶活性产生抑制作用,该作用呈现浓度和依赖性。4.为研究脂联素作用的特异性,采用si RNA在WKY RPT细胞中敲低Adipo R1和Adipo R2,结果发现脂联素对Na+-K+-ATP酶活性的抑制作用消失。5.Na+-K+-ATP酶活性检测发现,加入AMPK阻断剂和e NOS阻断剂后,脂联素对Na+-K+-ATP酶活性的抑制作用消失。同时,脂联素增加了磷酸化AMPK以及e NOS的表达,同时采用AMPK阻断剂后,脂联素对e NOS磷酸化增强的作用消失,说明脂联素通过AMPK-e NOS信号途径对WKY RPT细胞上的Na+-K+-ATP酶活性产生抑制作用。6.脂联素的利尿作用在SHR中受损。脂联素对Na+-K+-ATP酶的抑制作用在SHR的RPT细胞中同样受损。脂联素的作用得到了脂联素受体激动剂Adipo Ron的佐证:即:Adipo Ron具有利尿作用,该作用在SHR丧失。7.SHR肾脏脂联素受体表达量低于对照WKY大鼠,但其受体的表达量改变难以解释其功能丧失,因为过表达Adipo R1和Adipo R2后,其利尿作用仍不能恢复,说明还有其它因素参与。由于脂联素受体的磷酸化影响受体功能,我们的研究发现SHR肾脏脂联素受体磷酸化水平升高,提示高磷酸化水平可能是脂联素受体功能下降的原因。8.为验证GRK4是否参与调控脂联素受体磷酸化过程,我们采用GRK4?142V转基因小鼠灌注脂联素受体激动剂,发现脂联素受体参与调节的利尿作用消失。在SHR的RPT细胞中采用GRK4 si RNA干扰后,脂联素受体Adipo R1和Adipo R2的磷酸化程度减弱。这说明GRK4参与调控了脂联素受体的磷酸化,而脂联素促尿钠排泄作用的受损和脂联素受体在SHR中发生磷酸化相关。9.采用微泡包裹GRK4 si RNA,在SHR的肾脏进行靶向定位超声破碎微泡,释放出的GRK4 si RNA对GRK4产生抑制作用,肾脏脂联素受体的磷酸化水平减弱,SHR大鼠尿钠排泄增加,血压下降。同时,SHR肾功能未受到影响,肾纤维化得到改善。结论脂联素具有促肾脏尿钠排泄作用,在高血压状态下,这一功能受损;检测发现脂联素受体表达下调,但过表达受体后并不能完全恢复脂联素功能。受体的磷酸化可能在其中发挥重要的作用;GRK4活性增高是脂联素受体高磷酸化的原因;UTMD传输GRK4 si RNA有效抑制肾脏GRK4表达,在SHR可发挥降低血压、利尿排钠作用。