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单核细胞增多性李斯特菌(Listeria monocytogenes)简称单增李斯特菌,属革兰氏阳性胞内寄生菌,是一种重要的食源性人兽共患病原微生物。单增李斯特菌可在氧化等极端环境中生存,该抗氧化特性在其感染宿主过程中不可或缺。细菌中主要包含两套重要的巯基依赖性氧化还原系统,即硫氧还蛋白(Thioredoxin,Trx)和谷氧还蛋白(Glutaredoxin,Grx)系统。已知单增李斯特菌Trx系统在细菌抗氧化应激生物学过程中发挥至关重要的作用,但其中是否存在Grx系统尚未得知。通过生物信息学方法预测分析,单增李斯特菌含有一个Grx同源蛋白,该蛋白由lmo2344基因编码,并含有硫氧还蛋白家族(Thioredoxin family)保守的双半胱氨酸CXXC活性基序,但其生物学功能尚不得知。因此,本研究将结合分子生物学、应激生物学、细胞生物学等手段,重点探究单增李斯特菌Grx参与细菌抗氧化应激及介导细菌毒力过程中发挥的生物学功能和意义。研究结果如下:硫氧还蛋白家族成员属氧化还原蛋白,故采用经典胰岛素二硫键还原试验并进行酶活分析。单增李斯特菌Grx体外重组蛋白能够以DTT为电子供体催化还原胰岛素(氧化型,含二硫键),具备该家族蛋白还原酶特性。单增李斯特菌缺失grx后,细菌生长分裂能力未受影响,但细菌菌体显著变小(**P<0.01)。基于此结果,我们在普通BHI培养基中添加不同种类氧化剂,进行氧化应激点板试验。缺失grx后细菌在金属离子Cu2+、Cd2+和巯基特异性氧化剂肼(diamide)应激条件下相较于野生株生存能力显著增强。细胞感染试验结果表明,缺失grx菌株相较于野生株在巨噬细胞J774A.1存活及增殖能力显著增强(*P<0.05;**P<0.01);在肠上皮细胞Caco-2中黏附与侵袭能力显著增强(*P<0.05;**P<0.01);在成纤维细胞L929中侵袭及胞内增殖能力显著增强(**P<0.01),但细胞间迁移能力无明显变化。小鼠脏器增殖试验结果表明,细菌缺失grx后相较于野生株在肝脏和脾脏两个靶器官中的定殖能力显著增强(*P<0.05;**P<0.01),在小鼠模型中毒力增强。为进一步探索缺失grx后细菌抗氧化应激及毒力显著增强的原因,在4 m M巯基特异性氧化剂肼应激条件下,我们对李斯特菌野生株EGD-e和grx缺失株进行全基因转录组测序。grx缺失株中细菌抗氧化应激相关基因lmo0722、qox A、qox B、gr以及毒力相关基因inl A、inl B、opu CA、opu CB、opu CC、opu CD等基因的转录水平相较于野生株均显著上调。采用实时荧光定量PCR、荧光报告系统和蛋白质免疫印迹技术(Western Blot)验证转录组数据,该结果更直观表明Grx参与抗氧化应激及细菌毒力调控。凝胶电泳迁移试验(EMSA)结果说明Grx间接调控lmo0722、qox A/B、gr、opu CA/B/C/D、inl A/B基因。综上所述,本研究以单增李斯特菌谷氧还蛋白Grx为研究对象,首次探索Grx在氧化应激环境以及在宿主内感染和生存过程中发挥的抗氧化应激及毒力调控功能。本研究为完善包括李斯特菌在内的重要食源性病原菌的抗氧化应激生存及感染机制奠定了关键基础,且对于深入完善人兽共患病原菌的防控策略和保障公共卫生具有重要意义。