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研究背景:目前心血管疾病因其其高发病率和高病死率已经成为人类健康的重大问题。心肌梗塞(myocardial infarction,MI)主要是指心肌的缺血性坏死,心梗引起心肌细胞的大量死亡和瘢痕形成是导致心力衰竭的主要原因。在包括人类在内的成年哺乳动物中,由于成熟心肌细胞退出细胞周期停止增殖,成年心脏仅具备有限的再生能力。传统药物治疗、血管介入成形术和外科冠脉旁路移植术,这些方法虽然明显提高了缺血性心脏病(如心肌梗死)发生后的生存率和生活质量,但对心肌细胞的再生作用非常有限。我们前期的研究发现miR-17-92基因簇能够促进从胚胎到成年心脏的心肌增殖与再生。研究目的:本项研究旨在明确miR-17-92基因簇成员(miR-19a/19b)促进心肌再生修复的作用和调控机制以及心梗后心衰治疗策略。研究方法:本项研究通过Taqman探针法荧光定量PCR检测小鼠心脏发育成熟进程、及心脏疾病模型下心脏及心肌细胞中miR-19a/19b的表达量。除小鼠心梗模型外,还发现miR-19a/19b与扩张型心肌病及冠状动脉疾病的高度相关性。为验证miR-19a/19b在心脏中的作用,首先采用小鼠冠状动脉左前降支永久性结扎术模拟心梗及心衰模型,同时心肌内注射经过MaxSuppressorTM In Vivo RNALancerⅡ(一种新型高效脂质体包埋试剂)预处理的miR-19a/19b mimic或control mimic;此外,应用含心肌特异性启动子的腺相关病毒系统,在心梗同时心肌内注射miR-19a/19b的腺相关病毒及阴性对照病毒;为进一步阐述miR-19a/19b在心梗后心衰治疗中的作用,在心梗后6h,通过尾静脉注射miR-19a/19b mimic或 control mimic。miRNA mimic 分别采用 MaxSuppressor in vivo RNALancerⅡ 及Lipofectamine RNAiMAX两种递送试剂进行体内递送。随后,通过Taqman探针法荧光定量PCR检测miR-19a/19b的药物效应动态变化,并通过石蜡切片及免疫荧光技术检测荧光标记的miRNA mimic注射后在心脏中的动态分布情况。通过小动物心脏超声检测小鼠心脏功能。对心梗后小鼠心脏通过天狼星红/快绿染色进行组织形态学分析,并统计心脏梗死面积。通过qRT-PCR检测心衰及纤维化标志物基因表达情况。为了检测miR-19a/19b mimics参与调控心肌细胞增殖,在心梗且心肌内注射miRNA mimic后小鼠腹腔注射EdU使其在DNA复制过程中掺入基因组中,并通过免疫荧光检测心肌细胞中阳性EdU信号。进一步通过免疫荧光染色检测磷酸化组蛋白H3(pH3)及Aurora B 阳性的心肌细胞数。通过多彩报告系统谱系示踪技术(利用 Myh6-MerCreMer 和 R26R-Confetti(Brainbow2.1)转基因小鼠)检测miR-19a/19b促进心梗后心肌细胞增殖再生的作用。通过荧光定量PCR检测细胞周期相关基因CCNB1、CCND1、CDK1的基因表达水平。通过分离心梗且注射miRNA mimic后成年心肌细胞,定量心肌细胞数量。对分离得到的成年心肌细胞进行Connexin 43/a-actinin/DAPI染色,确定心肌细胞的完整性,及单核、双核、多核心肌细胞群所占比例情况。通过TUNEL染色及免疫印迹分析心梗且注射miRNA mimic后心肌凋亡情况。通过第二代RNA测序技术分析心梗后心肌内注射miR-19a/19b mimic及control mimic后转录组变化情况。并通过qRT-PCR验证分析表达下调的基因,进一步通过免疫组化及免疫印迹分析潜在信号通路。研究结果:第一部分:心脏生理病理条件下miR-19a/19b的表达情况1.小鼠心脏中miR-19a/19b主要于心肌细胞中表达,且出生后伴随心肌细胞退出细胞周期心脏中miR-19a/19b表达显著下调,提示miR-19a/19b可能参与调控心肌细胞增殖。2.小鼠MI模型中,MI后心脏中miR-19a/19b表达上调;小鼠主动脉缩窄(transverse aortic constriction,TAC)模型中未见 miR-19a/19b 表达上调。MI 模型中心肌细胞增殖数量增加,提示miR-19a/19b可能与心肌增殖的相关性。3.在扩张性心肌病(dilated cardiomyopathy,DCM)及冠状动脉疾病(coronary artery disease,CAD)的患者捐赠的心脏组织中miR-19a表达升高。提示在人类心脏疾病中miR-19a呈现差异表达。提示miR-19a与心脏疾病相关。第二部分:miR-19a/19b对MI后心脏的保护作用1.MI同时心肌内注射Cy3荧光标记的阴性对照组miRNA mimic,通过观察MI后2h至48h,miRNA mimic在心脏中的分布情况,确定MI同时心肌内注射miRAN mimic可高效迅速的进入心肌细胞,验证方法可行。小鼠MI手术同时分别心肌内注射 miR-19a mimic、miR-19b mimic 及 control mimic,单独注射 miR-19a mimic或miR-19b mimic均可改善MI后心脏功能,减少梗死面积。说明miR-19a和miR-19b均具有保护心梗后心脏的作用。2.小鼠MI手术同时心肌内注射miR-19a/19b mimic或control mimic,术后4天miR-19a高表达。随后恢复正常水平,术后2个月直至1年注射miR-19a/19b mimic组与注射control mimic组小鼠心肌中miR-19a无差异。提示miRNA mimic体内存留时间短,致癌致畸及致毒性风险低。3.小鼠MI手术同时心肌内注射miR-19a/19b mimic术后2个月,心脏功能改善,FS升高,LVID;s下降。梗死面积显著降低。BNP及β-MHC表达下调。第三部分:miR-19a/19b对于心梗后心脏的短期及长期保护作用1.小鼠MI手术同时心肌内注射miR-19a/19b mimic在心梗后早期及晚期均降低心梗小鼠的死亡率。2.小鼠MI手术同时心肌内注射miR-19a/19b mimic分别在MI后短期(2-4周,4个月)及长期(12个月)均使FS上调,LVID;s下调,保护心脏功能。在MI后12个月,降低心肌梗死面积,下调心脏纤维化及心肌病标志物基因表达。第四部分:miR-19a/19b促进心梗后成年心肌细胞增殖1.小鼠MI手术同时心肌内注射miR-19a/19b mimic明显增加EdU 阳性心肌细胞数量(MI后2个月);增加pH3阳性心肌细胞数量(MI后4天);增加Aurora B阳性心肌细胞数量(MI后4天);上调细胞周期相关标志物基因表达。2.通过对注射过Tamoxifen的Myh6-MerCreMer;Brainbow小鼠MI手术同时心肌内注射miR-19a/19b mimic,可明显增加相邻两个心肌细胞表达相同颜色荧光蛋白的概率,及miR-19a/19b促进MI后心肌增殖。3.小鼠MI手术同时心肌内注射miR-19a/19b mimic增加梗死后小鼠心肌细胞数量(MI后3周),且降低双核心肌细胞比例,增加单核心肌细胞比例。第五部分:miR-19a/19b参与调控梗死心脏中细胞死亡及炎症通路1.小鼠MI手术同时心肌内注射miR-19a/19b mimic降低心肌细胞及非心肌细胞中TUNEL 阳性细胞数;下调靶基因Bim及Pten在mRNA水平及蛋白水平表达。抑制Cleaved-caspase 3表达。证实miR-19a/19b抑制MI后心脏细胞死亡。2.通过转录组学测序,发现小鼠MI手术同时心肌内注射miR-19a/19b mimic下调 Immune response,Defense response,Interferon signaling 等信号通路相关基因表达(MI后4天)。3.小鼠MI手术同时心肌内注射miR-19a/19b mimic下调M1期标志物基因(IL-1β,IL-6,TNF-a,CD68,MCP-1)表达,上调 M2 期标志物基因(Arg-1,CD163,IL-10)表达。通过免疫组化观察发现,M1期标志物CD80、iNOs下调,M2期标志物Arg-1上调。提示miR-19a/19b抑制MI后心脏免疫炎症反应,且miR-19a/19b抑制MI心脏免疫炎症反应可能通过SOCS1/3调控STAT3磷酸化活化的信号通路。第六部分:腺相关病毒介导miR-19a/19b在心肌中过表达保护MI后心脏功能1.小鼠MI手术同时心肌内注射AAV9-miR-19a/19b病毒后增强MI后心脏功能(MI后7天,注射AAV9-miR-19a/19b病毒组FS呈现上调趋势,LVID;s呈现下调趋势;MI后14天、2个月及3个月,注射AAV9-miR-19a/19b病毒组FS均显著升高,LVID;s明显下调)。且降低MI后心脏梗死面积。2.小鼠MI手术同时心肌内注射AAV9-miR-19a/19b降低心肌病标志物基因(ANP,BNP,β-MHC)及心脏纤维化标志物基因(Col1a1,Col3a1,Tgfbr2)表达,并下调靶基因PTEN蛋白水平表达。第七部分:miR-19a/19b在心梗后心衰进程中的潜在治疗作用1.在小鼠MI手术后6h通过尾静脉首次注射miR-19a/19b mimic或control mimic,每24h注射一次,连续注射三次。分别通过RNALANCEr II及RNAiMAX两种试剂对miR-19a/19b向小鼠体内递送。均对MI心脏功能起到有效的治疗作用(MI后2周、6周、11周及14周可见miR-19a/19b mimic注射组小鼠心脏FS均上调,LVID;s下调,MI后14周可见梗死面积减少)。且miR-19a/19b mimic通过尾静脉给药的方式同样在MI小鼠心脏中下调SOCS1,上调P-STAT3/STAT3信号。结论:miR-19a/19b促进心梗后心肌再生修复,并通过调控细胞死亡及免疫炎症反应改善心梗后细胞死亡及心脏重构;明确了 miR-19a/19b在心梗后心衰进程中的治疗作用。