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氧化应激是酒精造成肝脏损伤的重要途径,缓解酒精引起的肝细胞氧化应激对酒精性肝病的预防和治疗具有重要意义。HPPCn(Hepatopoietin Cn,HPPCn)是本实验室发现的一种新型肝细胞刺激因子,它能够特异性的促进肝脏再生和肝源细胞系的增殖,并对CCl4造成的大鼠肝纤维化具有治疗作用。本文拟研究其对酒精引起的肝脏氧化应激的影响及其作用机制。我们通过工程菌BL21(DE3)/pET-24a(+)-HPPCn高密度发酵生产重组人HPPCn蛋白(rhHPPCn)。发酵过程采用溶氧反馈调节,IPTG(isopropylβ-D-1-thiogalactopyranoside,IPTG)诱导蛋白表达,共得菌体干重约480 g,包涵体形式表达的rhHPPCn 51 g。包涵体蛋白经过变性和复性后进行Q-XL阴离子交换层析,得到纯化的蛋白共19.2 g。我们利用AdEasyTM系统构建了携带HPPCn基因的重组腺病毒Ad-SP-HPPCn,为使表达HPPCn蛋白分泌到胞外,我们利用重组PCR技术在HPPCn基因上游添加了信号肽序列。经过HEK293细胞扩增和CsCl密度梯度超高速离心纯化,病毒滴度达到1.6×1011 pfu/ml。我们以人正常肝细胞系L02为研究对象,考察rhHPPCn对酒精引起的肝细胞氧化应激的影响。结果发现,100 mM乙醇作用12 h可引起L02细胞损伤,细胞谷氨酸草酰乙酸转氨酶GOT(glutamic oxaloacetic transaminase,GOT)释放明显升高,细胞内活性氧簇ROS(reactive oxygen species,ROS)过量积累,细胞内超氧化物歧化酶SOD(superoxide dismutase,SOD)活力降低,还原型谷胱甘肽GSH(reduced glutathione hormone,GSH)含量减少。而提前给予rhHPPCn能显著缓解乙醇引起的肝细胞损伤,细胞GOT释放减少,细胞SOD和GSH维持在正常水平,rhHPPCn提高了细胞清除ROS的能力,使细胞氧化应激减轻。另外,rhHPPCn还能够激活L02细胞中ERK和SPK两条保护性信号通路,提示其可能通过这两条通路发挥保护肝细胞,减轻氧化应激的作用。利用昆明小鼠酒精灌胃模型进行的体内实验显示,急性酒精摄入造成小鼠肝脏出现明显病理改变,血清中谷氨酸丙酮酸转氨酶GPT(glutamate-pyruvate transaminase,GPT)含量升高,血清和肝脏中甘油三酯TG(triglyeride,TG)增加,肝脏丙二醛(malondialdehyde,MDA)水平和4-HNE(4-Hydroxynonenal,4-HNE)蛋白质加成物含量增加,这些损伤小鼠肝脏中CYP450 2E1表达升高,SOD活力和GSH含量降低有关。预先给予rhHPPCn或Ad-SP-HPPCn能明显缓解小鼠肝脏的氧化应激状态,减轻酒精造成的肝脏损伤。