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龙胆酸代谢途径是芳香族化合物代谢过程中重要的中心代谢途径。目前关于该途径的研究多处在细菌的生理层面上,并集中在革兰氏阴性细菌。实验证据表明,在革兰氏阳性细菌中的龙胆酸代谢机制与革兰氏阴性细菌之间存在明显的差异。
本文从分子水平及生化方面对高G+C革兰氏阳性菌Rhodococcus和低G+C革兰氏阳性菌Paenibacillus中的龙胆酸代谢途径进行了研究,并且对处于不同分类地位细菌间的龙胆酸途径进行了比较,使得对龙胆酸代谢途径有了新的认识,并对其代谢多样性提供了新的证据。Rhodococcus sp. NCIMB12038通过水杨酸-龙胆酸途径降解萘。为了鉴定该途径中涉及的基因,通过Genome walking的方法从NCIMB12038菌株中克隆了12,052-bp的基因片段。在预测的13个开放阅读框中有3个基因(narIKL)编码和龙胆酸代谢相关的酶。NarI为龙胆酸1,2-双加氧酶,NarL为分枝硫醇依赖的顺丁烯二酸单酰丙酮酸异构酶,NarK为反丁烯二酸单酰丙酮酸水解酶。龙胆酸在这3个酶的顺序催化下降解成反丁烯二酸和丙酮酸。在龙胆酸基因簇上游,与nar IKL转录方向相反的nar基因编码3-羟基苯甲酸6-单加氧酶,而不是水杨酸5-单加氧酶。这使我们发现NCIMB12038菌株也能以3-羟基苯甲酸作为唯一的碳源和能源生长。研究表明,该菌中萘和3-羟基苯甲酸的降解共用此龙胆酸途径。龙胆酸代谢途径中Glutathione(GSH)和Mycothiol(MSH)依赖的顺丁烯二酸单酰丙酮酸异构酶分别分布在革兰氏阴性菌和高G+C革兰氏阳性菌中。本文利用热处理法从土壤中分离得到一株通过龙胆酸途径降解3-羟基苯甲酸的菌株NyZ101,经16S rDNA序列比对,该菌为Paenibacillus属,属于低G+C革兰氏阳性菌。通过Genome walking的方法从该菌中获得了6.5-kb的DNA片段,包含3-羟基苯甲酸-龙胆酸代谢的相关基因(bagXILK)。其中bagX编码3-羟基苯甲酸6-单加氧酶,bagI编码龙胆酸1,2-双加氧酶,bagK编码反丁烯二酸单酰丙酮酸水解酶。基因bagL位于bagI和bagK之间,在氨基酸序列上和任何已知功能的蛋白没有同源性。通过体外表达纯化和功能验证,BagL是一个同型二聚体,能以cysteine和GSH作为辅因子催化顺丁烯二酸单酰丙酮酸异构成反丁烯二酸单酰丙酮酸,cysteine作为辅因子的亲和力比GSH高80倍。根据报道,芽胞杆菌中富含cysteine和CoA等巯基化合物,GSH含量很少或检测不到。因此在生理条件下,BagL应该是依赖于cysteine的,是一种新型的顺丁烯二酸单酰丙酮酸异构酶。我们推测,巯基化合物在不同分类菌中的分布和丰度很可能是异构酶在进化过程中的选择压力。