目的富血小板血浆(Platelet-Rich Plasma,PRP)为自体全血利用梯度离心原理离心获得的血小板浓缩物,由激活剂或物理因素激活后能释放多种细胞因子,如转化生长因子-β、血小板源性生长因子、胰岛素样生长因子、表皮生长因子、上皮细胞生长因子、血管内皮细胞生长因子等。以上这些细胞因子在特定条件下能够诱导促进多种细胞的形态发生迁移、分化和增殖,参与伤口愈合中新生血管的形成以及骨的再生;而激活后的PRP呈凝胶状,纤维黏连蛋白、富含纤维蛋白等蛋白质,可以作为天然的三维支架材料供细胞生长,为组织的再生创造优良的局部微环境。目前关于PRP的制备方法的文献报道很多,研究发现不同的制备方法会影响到最终PRP中血小板以及生长因子的浓度,影响其作用效果的发挥。脂肪干细胞(adipose-derived stem cells,ADSCs)为近年来由脂肪组织中分离出的一种具有多向分化潜能的干细胞,在特定条件诱导下可以向成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、平滑肌细胞和心肌细胞分化。自体ADSCs由于其取材方便,体外扩增速度快等特点,可以作为组织工程技术中优秀的种子细胞,用于组织器官的修复再生。尽管以往的研究证实PRP可以对多种细胞起作用,但关于PRP对ADSCs的研究较少。本研究采用三种不同方法制备PRP,比较PRP产物中血小板浓度以及生长因子释放量的差别;并将PRP和ADSCs共培养,分析PRP对ADSCs增殖和成骨分化的影响,探讨PRP+ADSCs复合材料用于组织工程技术的可能性,为以后的临床研究打下基础。方法1.本研究采用了传统的二次离心法、三次离心法以及Tubex改良法制备PRP,通过血小板计数比较三种方法制备PRP的血小板采集率的大小;2.通过酶消化组织块法分离出兔脂肪干细胞,并通过流式细胞术、茜素红染色和油红O染色方法鉴定细胞;3.将三种方法制备的PRP激活后配成5%浓度的细胞培养液,与上述的脂肪干细胞共培养,通过CCK-8试剂盒检测PRP对细胞增殖的影响;4.将三种方法制备的5%PRP培养液处理细胞,通过茜素红染色、碱性磷酸酶染色和定量、RT-PCR检测PRP对脂肪干细胞成骨分化能力的影响。结果1.血小板计数结果发现Tubex改良法制备的PRP血小板回收率显著高于其他两种方法,PRP中的生长因子浓度也明显高于二次离心法和三次离心法。2.本实验中经过酶消化法获得的细胞表面特定抗原的表达与脂肪干细胞一致,且具备成骨分化和成脂分化能力,符合脂肪干细胞特征。3.在培养21d后,所有PRP处理组的脂肪干细胞均观察到了矿化结节的形成,细胞的碱性磷酸酶活性也显著高于矿化诱导液处理的细胞,通过实时定量PCR观察到脂肪干细胞成骨分化标记基因的表达也明显高于矿化诱导组。通过比较三种PRP对脂肪干细胞成骨分化的影响,我们发现Tubex法制备的PRP对脂肪干细胞成骨分化的促进作用要强于其他两种方法制备的PRP。结论:综合以上研究结果,我们发现Tubex法制备的PRP中血小板的含量以及生长因子的浓度均要高于二次离心法和三次离心法,其对兔脂肪干细胞的增殖、成骨分化具有明显的促进作用,且其作用效果优于其他两种方法。通过Tubex密闭装置制备PRP操作简单,同时能够提高血小板的采集率,其内丰富的细胞因子有利于脂肪干细胞的增殖和分化。