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研究背景由于脊髓容易受到各种生物和理化因素的损伤,而神经细胞损伤后的再生能力极差,因而,一般认为,脊髓损伤（spinal cord injury,SCI）造成病人局部神经功能损害甚至四肢瘫痪,表现为大小便失禁和损伤平面以下的感觉、运动等功能永久性缺失。SCI之后的功能缺失是主要是因为轴突受到破坏,神经元和胶质细胞死亡还有脱髓鞘变化等所致。而目前临床上对SCI的治疗缺少有效的方法,药物治疗主要应用大剂量的类固醇激素及支持疗法等;外科治疗主要是恢复脊柱的稳定性和椎管减压手术等。近年来,神经干细胞移植的兴起为SCI后的神经功能修复提供了新的治疗方法。新近的神经细胞移植实验表明细胞用于治疗脊髓损伤疗效明显,细胞移植疗法不仅替换了受损神经细胞,还分泌了细胞生长必不可少的神经因子并限制了胶质瘢痕的生长,因而将种子细胞在体外扩增后进行细胞移植是目前修复脊髓损伤最有希望的手段之一。雪旺细胞（Schwann cells,SCs）是构成了周围神经髓鞘的重要细胞,SCs在外周神经再生中起关键作用。SCs作为种子细胞之一,取材方便,来源广泛,遗传性状稳定,是最前应用于SCI移植修复的细胞之一,已有部分实难表明,在脊髓损伤之后,位于周围神经系统的SCs可迁移到受损部位,参与脊髓修复的过程。此外,SCs具有许多功能,包括①分泌神经营养因子如神经生长因子,脑源性神经营养因子,睫状神经营养因子等;②生产和释放细胞外基质分子,如层粘连蛋白;③促进损伤后的轴突再生,引导轴突长进中央束并髓鞘化;④保护受损神经元,改善微循环。而另一方面,细胞移植后如何在体内转归仍然通过处死动物后行组织免疫学的方法确定,移植后细胞的存活,分布,迁移,分化无法得到无创的实时的有效的监测,因而尚无法在临床上进行评价。目前,得益于磁共振成像（MRI）的分子影像学的快速发展,细胞移植后的无创的活体示踪成为可能。超小顺磁性氧化铁（USPIO）Sinerem作为一种新型的磁共振造影剂,已获得FDA的批准,并已成功应用于多种细胞的标记。本课题组已将其应用于雪旺细胞SCs的研究,并取得肯定的效果。而到目前为止,Sinerem对SCs的生物学影尚无系列的相关报道,本课题旨在体外通过多种方法研究标记前后的SCs的细胞活力,增殖能力以及凋亡等情况,力求探索标记SCs的适宜浓度,为SCs移植治疗SCI模型的体内实验提供实验依据及相关的技术参考。第一部分低浓度胰酶多次差速酶消培养和纯化乳鼠雪旺细胞的实验研究目的:观察SCs体外培养,纯化及传代的情况,熟练掌握细胞培养技术,为下一步实验奠定基础方法:取新生3-5d的S D乳鼠,无菌条件下解剖后取出双侧臂丛及坐骨神经,制成单细胞悬液后以3×105个/ml的细胞悬液接种于预铺PLL过夜的25cm2培养瓶中。用低浓度胰酶多次差速酶消纯化SCs,在倒置的相差显微镜下观察细胞的形态和数量等生长情况。采用免疫荧光法鉴定,P75NTR是SCs的细胞表面分子,利用其对SCs的特异性鉴别。结果:SCs接种后,主要以单个圆形漂浮的细胞为主,少数细胞聚集成团块状;24 h后,大部分细胞已贴壁,其中较多的细胞可见明显的突起伸出,体积较小,可见细胞呈双极状,立体感较强;继续培养,轴突变长,72h后细胞间轴突相连,相互缠绕交汇成网状;同时可见另一种细胞,体积较大,形态不规则,色泽黯淡的细胞铺在下面;用低浓度消化酶纯化后绌胞排列规则,紧密有序,或成直线,或相互平行,呈栅栏状,纺缍状或漩涡状排列;细胞形态单一,只有极少数体积较大的扁平细胞。高倍镜下可见SCs瘦长,胞体周围有明亮的光晕,中间圆两头尖,两侧伸出两个到三个长长的轴突,细胞与细胞之间通过轴突相连。P75NTR是特异性地标记SCs,在荧光显微镜下,阳性细胞被激发后发出红色荧光。证实培养出来的细胞是特异性表达P75的细胞,免疫荧光可见P75的表达。结论:乳鼠SCs能在体外进行培养和扩增,生长增殖能力较旺盛,能特异性地表达P75,是进行脊髓损伤修复的种子细胞之一。低浓度胰酶多次差速酶消纯化乳鼠SCs方法,无须添加特殊的试剂和药物,操步骤相对比较简单,实验重复性强,提纯的SCs可达到95%以上,是一种安全快速,简单有效的细胞培养方法。第二部分超小超顺磁性氧化铁Sinerem对大鼠雪旺细胞生物学活性影响目的:应用超小超顺磁性氧化铁（USPIO）Sinerem和转染试剂多聚赖氨酸（PLL）复合物标记乳鼠雪旺细胞,初步评价Sinerem安全性及合适的标记浓度,为今后的进一步研究工作提供技术参考。方法:取SD乳鼠坐骨神经和臂丛神经,用胶原酶消化后进行原代培养,并用超低浓度胰酶提纯,将制备的不同浓度的sinerem-PLL复合物和雪旺细胞共孵育培养48h;细胞的生长情况通过倒置的相差显微镜观察,氧化铁颗粒在胞内的存在通过普鲁斯蓝染色及透射电镜证实,细胞周期及细胞凋亡通过流式细胞仪进行分析比较,细胞生长增殖影响通过CCK—8法检测,细胞扫描用3.0T MR在体外进行数列分析。结果:普鲁士蓝染色和透射电镜观察显示细胞质内有铁颗粒存在;CCK—8法检测结果表明,100μg/ml～800μg/ml不同浓度范围的sinerem对细胞生长增殖的影响差异无统计学意义。流式细胞仪检测结果显示,500μg/ml的sinerem对细胞的生长周期及细胞凋亡和死亡的没有明显的影响。结论:1.不同浓度的Sinerem-PLL复合物可以用来体外标记乳鼠SCs2.随Sinerem浓度的增高,其标记效率亦增高,且标记后T2 WI信号改变愈明显。浓度在800μg/ml以下时,应用Sinerem-PLL复合物标记SCs安全、有效。3.200μg/ml是Sinerem标记细胞的适宜浓度,是安全,有效,节省资源的浓度。因此,应用sinerem-PLL复合物标记细胞是可行的,在适宜的标记浓度下,在体外成像效果较佳。