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树突状细胞(Dendriticcell,DC)是目前所知的功能最强、并且唯一能激活初始性T细胞(NTcell)的专职抗原提呈细胞(Antigen-presenringcell,APC),能摄取各类抗原,体内、外均能激发T细胞增殖,诱导特异性细胞杀伤性T淋巴细胞(cytotoxicTlymphocytes,CTL)生成,产生抗肿瘤效应,在免疫应答中处于中心地位。DC独特的免疫调节作用使之成为免疫学研究的热点,并在细胞治疗领域具有广阔的应用前景。临床和研究中使用的DC通常为人外周血单核细胞(peripheralbloodmonoudearcell,PBMC)在多种细胞因子作用下体外诱导一周得到。目前已有多个实验室正致力于发展一种体外培养系统,在体外模拟体内微环境来诱导单核细胞向DC分化,以重建体内单核细胞向DC分化时细胞间相互作用和信号通路,并且取得了很好的结果。
本论文成功构建了两种包含GM-CSF和ILA的慢病毒表达质粒;包装获得的重组慢病毒可以高效的感染内皮细胞系EA.hy926细胞,感染后的重组细胞经RT-PCR、Westernblot及ELBA等多种方法进行蛋白翻译表达的鉴定,经鉴定感染后细胞分别可以高效表达细胞因子GM-CSF和IL4,感染后细胞的生长状态均良好,能够在体外进行长期传代培养,可以用于DC诱导实验;丝裂霉素C(MMC)可以抑制细胞增殖,但不改变细胞分泌蛋白的性质,是体外常用的制备饲养层的方法之一,我们通过试验最终确定了MMC的作用时间和浓度,以便以后将重组的EA.hy926细胞制备成饲养层细胞来促使人外周血单核细胞分化成为DCs。
本论文共分两部分,具体如下:
一、建立两种分别表达GM-CSF和IL-4基因的重组EA.hy926内皮细胞系
利用PCR方法扩增出目的GM-CSF基因和IL4基因。将目的基因分别构建入慢病毒表达载体pBPLV,得到两种重组的慢病毒表达载体。该两种重组慢病毒分别经双酶切和测序鉴定显示重组质粒构建成功。重组慢病毒载体和慢病毒包装质粒、包膜质粒共转染293T细胞,转染24h后经荧光显微镜观察转染效率达到90%以上;收集细胞培养上清然后高速离心浓缩病毒原液,浓缩后的病毒可以有效的感染内皮细胞系EA.hy926细胞,感染后的细胞经过扩大培养后感染效率依然可达到90%以上,说明目的基因可以在感染细胞内稳定的传代,重组EA.hy926内皮细胞系构建成功。
二、重组EA.hy926内皮细胞系细胞性质的确定
对感染后细胞进行生长曲线的测定,结果显示感染后细胞的生长趋势没有受到影响,能够很好的进行增殖;经RT-PCR反应在mRNA水平上能检测到目的基因的表达;ELISA方法表明感染后细胞IL-4、GM-CSF在蛋白水平的表达分别是未感染细胞的80倍和143倍;Westernblot方法检测到重组细胞培养上清中有细胞因子IL-4和GM-CSF的表达;在丝裂霉素C(MMC)抑制内皮细胞系生长的实验中,确定了在处理时间为2.5h时,MMC的浓度选择为10μg/ml。在此浓度作用下,内皮细胞系生长受到抑制,但是保持其分泌的功能。