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第一部分人食管癌多药耐药细胞株的建立及其生物学特性目的：建立人食管癌细胞多药耐药细胞株(YES-2/DDP),并分析其生物学特性。方法：本实验应用顺铂浓度递增和间歇诱导法建立YES-2/DDP耐药株。采用CCK-8法检测不同抗肿瘤药物对人食管癌野生型和耐药型细胞的增殖作用影响,计算半数抑制率(IC50)和耐药指数(RI),并观察冻存、撤药对耐药稳定性的影响。进一步比较野生与耐药细胞株细胞贴壁率、生长曲线、群体倍增时间的差异,并用双层软琼脂实验观察YES-2/WT(人食管癌野生型)和YES-2/DDP克隆形成率。流式细胞仪检测细胞周期、罗丹明外排、细胞凋亡。免疫印迹法检测耐药相关蛋白(MDR-1,MRP-1和LRP)的表达。结果：历时九个月诱导的人食管癌YES-2/DDP耐药细胞株对顺铂的耐药指数为16.4,并且YES-2/DDP对其它不同类型的抗肿瘤药物均产生不同程度的耐药,冻存和撤药对YES-2/DDP的耐药指数无明显影响。相对于YES-2/WT细胞株,YES-2/DDP生长曲线缓慢,细胞群体倍增时间延长,细胞克隆形成率显著增加,细胞周期中G1和S期所占比例增加而G2期减少。免疫印迹发现YES-2/DDP耐药细胞株MRP1表达明显增强,而MDR1和LRP表达无明显变化。细胞内罗丹明外排出实验发现YES-2/DDP细胞内罗丹明明显减少。用10μg/ml的顺铂分别处理YES-2/WT和YES-2/DDP细胞72小时后,流式细胞和荧光显微镜分析表明DDP对耐药细胞YES-2/DDP的凋亡率明显减少。结论：成功建立人食管癌多药耐药细胞株YES-2/DDP,其耐药机制可能与MRP1的表达增加,导致抗癌药物摄入减少,外排增多。减少药物对肿瘤细胞的凋亡作用相关。第二部分人食管癌细胞多药耐药机制的初步研究目的：研究COX-2、PPAR-β在人食管癌细胞多药耐药中的作用,分析COX-2、PPAR-β、MRP-1三者之间的关系,揭示人食管癌细胞发生多药耐药的机制。方法：1、首先用免疫印迹法检测YES-2/WT和YES-2/DDP细胞中COX-2、 PPAR-β的表达,用酶联免疫法和荧光素酶检测仪测定PGE2的生成和PPRE报告基因活性,以评价COX-2、PPAR-β、的活性。2、分别用25μM的COX-2特异性抑制剂NS398或1μM的PGE2干预YES-2/DDP耐药细胞株72小时,免疫印迹法检测MRP-1和PPAR-β的表达,荧光素酶检测仪测定PPRE报告基因活性,流式细胞仪检测细胞内罗丹明浓度以明确细胞外排药物能力,CCK-8检测不同浓度顺铂处理不同干预组细胞48小时后细胞增殖能力,以评价顺铂的半数抑制率(IC50)和耐药指数(RI)。进一步用110μg/ml的顺铂分别处理上述干预组的YES-2/DDP细胞株,高效液相法测定顺铂处理1小时后细胞内顺铂浓度,流式细胞仪检测顺铂处理72小时后细胞凋亡率。3、分别用2μM的PPAR-β特异性抑制剂GSK0660或转染5gg的PPAR-β表达质粒干预YES-2/DDP耐药细胞株72小时,免疫印迹法检测MRP-1和COX-2的表达,酶联免疫法测定细胞上清中PGE2含量,流式细胞仪检测细胞内罗丹明浓度以明确细胞外排药物能力,CCK-8检测不同浓度顺铂处理不同干预组细胞48小时后细胞增殖能力,以评价顺铂的半数抑制率(IC50)和耐药指数(RI)。进一步用10μg/ml的顺铂分别处理上述干预组的YES-2/DDP细胞株,高效液相法测定顺铂处理1小时后细胞内顺铂浓度,流式细胞仪检测顺铂处理72小时后细胞凋亡率。结果：1、与YES-2/WT细胞相比,YES-2/DDP细胞COX-2蛋白表达和PGE2生成量增加,PPAR-β蛋白表达和PPRE活性也增加,同时MDR1蛋白表达增加,细胞内顺铂浓度明显降低,10μg/ml顺铂处理细胞后凋亡率也明显减少。2、与YES-2/DDP细胞相比,25μM的COX-2特异性抑制剂NS398干预YES-2/DDP后,MRP-1和PPAR-β蛋白表达明显降低,PPRE活性减少,细胞内罗丹明浓度增高,同时顺铂的半数抑制率(IC50)和耐药指数(RI)明显减少；10μg/ml顺铂分别处理NS398干预的YES-2/DDP细胞后,细胞内顺铂浓度增高,72小时凋亡率也明显增加(均相对于YES-2/DDP细胞,P<0.05)。与YES-2/DDP细胞相比,1μM的PGE2干预YES-2/DDP后,MRP-1和PPAR-β蛋白表达明显增加,PPRE活性也增加,细胞内罗丹明浓度减少,同时顺铂的半数抑制率(IC50)和耐药指数(RI)明显增加；10μg/ml顺铂处理NS398干预的YES-2/DDP细胞后,细胞内顺铂浓度减少,72小时凋亡率也明显减少(均相对于YES-2/DDP细胞,P<0.05)。3、与YES-2/DDP细胞相比,2μM的PPAR-β特异性抑制剂GSK0660干预YES-2/DDP后,COX-2表达和PGE2含量无明显变化,但MRP-1蛋白表达明显降低,细胞内罗丹明浓度增高,同时顺铂的半数抑制率(IC50)和耐药指数(RI)明显减少；10μg/ml顺铂分别处理NS398干预的YES-2/DDP细胞后,细胞内顺铂浓度增高,72小时凋亡率也明显增加(均相对于YES-2/DDP细胞,P<0.05)。与YES-2/DDP细胞相比,转染5μg的PPAR-β表达质粒干预YES-2/DDP后,COX-2表达和PGE2含量无明显变化,但MRP-1蛋白表达明显增加,细胞内罗丹明浓度减少,同时顺铂的半数抑制率(IC50)和耐药指数(RI)明显增加；10μg/ml顺铂处理NS398干预的YES-2/DDP细胞后,细胞内顺铂浓度减少,72小时凋亡率也明显减少(均相对于YES-2/DDP细胞,P<0.05)。结论：1、COX-2蛋白表达和PGE2生成介导MRP1的表达,促进细胞内顺铂的外排,减少抗肿瘤药物对人食管癌细胞的毒性作用。2、PPAR-β蛋白表达和激活也介导MRPl的表达,促进细胞内顺铂的外排,减少抗肿瘤药物对人食管癌细胞的毒性作用。3、人食管癌细胞的耐药形成可能是通过促进COX-2/PGE2系统,上调PPAR-β蛋白表达和活性,进一步介导MDR1的表达,促进抗肿瘤药物的外排,减少肿瘤细胞内抗肿瘤药物的浓度,从而减少细胞对药物的毒性作用,产生多药耐药。第三部分粉防己碱对YES-2/DDP耐药细胞株的干预作用及机制目的：研究粉防已碱对人食管癌YES-2/DDP耐药细胞株MRP-1的影响,并进一步探讨其可能的机制及生物学效应,为人食管癌多药耐药的干预寻找有效的治疗药物。方法：以人食管癌耐药细胞株YES-2/DDP为多药耐药细胞模型,实验分为四组,用不同剂量的粉防已碱干预耐药细胞株YES-2/DDP,分别为对照组(无粉防已碱干预)、10μM粉防已碱干预组、3.0gM粉防已碱干预组、100μM粉防已碱干预组。在粉防已碱干预72小时后,免疫印迹法检测COX-2、PAR-β和MRP的表达,酶联免疫法检测PGE2含量,荧光素酶法检测PPRE的活性,流式细胞仪检测细胞内罗丹明浓度。进一步用10μg/ml浓度的顺铂继续处理上述各组细胞,分别在1小时后高效液相仪测细胞内顺铂浓度,48小时后用CCK-8检测各组对顺铂的半数抑制率(IC50)和耐药指数(RI)。结果：1、与YES-2/DDP对照组细胞相比,粉防已碱呈剂量信赖性地抑制COX-2的表达,PGE2的生成,PPAR-β蛋白表达和PPRE的激活。同时也抑制MRP的表达和细胞内罗丹明的蓄积。2、用10μg/ml浓度的顺铂处理不同干预组细胞后,粉防已碱呈剂量依赖性地增加细胞内顺铂浓度,同时顺铂的半数抑制率(IC50)和耐药指数(RI)明显减少。结论：粉防己碱可逆转YES-2/DDP耐药细胞株中耐药性的产生,其机制有可能与其抑制COX-2的表达后,依次下调细胞中PGE2、PPAR-β与MRP的表达水平,从而减少药物外排有关。