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同种异体移植血管硬化疾病是心脏移植长期存活患者主要的死亡原因。其病理生理机制复杂，目前尚未阐明，也无有效的治疗措施，重点在于预防。 本研究把构建和鉴定重组质粒PLXSN-eNOS，应用脂质体介导转染方法直接转染移植动脉，探讨eNOS基因对同种异体移植血管硬化的预防作用。本研究分为二个部分：第一部分应用PCR和双酶切技术对构建的重组质粒PLXSN-eNOS进行鉴定；第二部分应用RT-PCR方法证实质粒PLXSN-eNOS是否成功转染移植血管，并通过检测各项指标探讨eNOS基因治疗对同种异体移植血管硬化的预防作用。 在质粒PLXSN-eNOS构建实验过程中，首先用内切酶ECORⅠ和hindⅢ分别对质粒PGEM-3zf-eNOS和Pblue双切酶后，载体Pblue和eNOS目的基因进行连接反应，构建质粒Pblue-eNOS；其次用内切酶ECORⅠ和XhoⅠ分别对质粒Pblue-eNOS和PLXSN双酶切后，载体PLXSN和eNOS目的基因进行连接反应，构建质粒PLXSN-eNOS；最后质粒PLXSN-eNOS进行双重鉴定：PCR鉴定电泳形成760kb一条带；内切酶ECORⅠ和XhoⅠ双酶切鉴定电泳形成二条带。PCR和双酶切鉴定证明质粒PLXSN-eNOS构建成功。 在PLXSN-eNOS-LF2000脂质体转染移植颈总动脉实验中，把SD大鼠颈总动脉原位移植于Wistar大鼠，应用11-0无损伤线，借助显微外科技术进行大鼠移植颈总动脉端端吻合。实验分为对照组和实验组。对照组和实验组供体颈总动脉分别浸泡于PLXSN-LF2000脂质体和pLxSN一eNOS一LFZ000脂质体溶液30min后。实验进行以下三方面的研究;(1)RT一PCR方法分别对术后1、7、14和28天的实验组移植动脉进行检测，观察eNOS基因是否转染移植血管。(2)免疫组化方法检测各个时f司点移植动脉eNOS、iNOS，NF一kB、ICAM一1和VCAM一l表达变化。 (3)光镜和电镜分析移植血管病理变化以及内膜与中层平滑肌增生比例的检测。 实验结果表明:(1)术后7、14和28天，实验组移植血管RT一PCR检测，琼脂糖胶电泳图像分析可见2条带，证明外源性基因。NOS成功转染血管。(2)对照组eNOS和iNOS表达变化:术后1、7、14和28天，移植血管内皮细胞eNOS在明显减弱;移植血管内膜iNOS表达明显增强，iNOS主要是平滑肌细胞、单核/巨噬细胞和内皮细胞阳性表达，移植血管中层平滑肌细胞iNOS表达在术后1和7天增强，但术后14和28天后，逐渐降低。实验组eN0s和iNOS表达变化:移植血管内皮细胞eNOS表达明显增强，内膜平滑肌细胞时可见表达:内膜iNOS表达明显减弱;移植血管中层iNOS的表达在术后1和7天减弱，但在术后14和28天，与对照组相比没有明显区别。(3)术后1、7、14和28天，对照组移植血管内膜ICAM一和VCAM一的表达明显增强，实验组ICAM一1和VCAM一1表达减弱。(4)术后1、7、14和28天，对照组移植血管内膜NF一kB表达增强，实验组NF一kB表达减弱。(5)光镜和电镜移植血管病理变化:对照组在移植术后28天，血管内膜弥慢性增厚，累及整圈血管内膜，管腔明显变狭窄，内膜下平滑肌细胞明显增加，大量的细胞外基质形成。中层变薄，部分平滑肌细胞退化。弹力纤维层保持完整。内膜中层比例增加。eNOS转基因治疗后，内膜增生和管腔狭窄明显减轻，没有明显的单核/巨噬细胞浸润。中层平滑肌细胞保持完整。电镜可见移植血管内膜增厚，单核/巨噬细胞浸润，内膜下层 3含有大量的平滑肌细胞，丰富的细胞外基质和胶原纤维，中层平滑肌细胞退化。 根据以上实验结果，可以得出以下结果 1.PCR和内切酶ECORI和Xhol双酶切鉴定证明PLXSN一eNOS质粒 成功构建。 2.PLXSN一eNOS一LF20OO脂质体直接浸泡能转染移植总动脉。 3.eNOS转基因治疗能维持同种异体移植血管内膜eNOS的正常表 达，抑制iNOS、ICAM一1、VCAM一1和NF一kB的表达，减轻血管 内膜增生，预防同种异体血管疾病