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本课题组前期的研究结果表明:由课题组发现并已成功申请专利的人乳头瘤病毒(HPV)主要衣壳蛋白L1C-末端共同保守序列多肽,能够诱导动物产生的抗血清,对多种型别HPVL1具有交叉的免疫反应性,并且对多种HPV型别具有检测能力和一定的中和HPV病毒能力。本课题主要任务就是进一步评价该多肽抗体检测HPV感染能力和多肽抗血清中和HPV病毒能力情况,目的就是为HPV检测试剂盒和HPV预防性疫苗的开发、研究做理论基础和前期工作。本课题的研究内容主要包括以下两大部分: 第一部分:HPVL1多肽抗体评价HPV感染检测能力 目的:进一步确证HPVL1多肽抗体是否具有检测HPV感染能力,评估其检测效价。方法:1)收集临床宫颈脱落细胞标本,一式两份;2)一份标本采用商用的潮州“凯普HPV分型检测试剂盒”进行HPV型别鉴定,统计HPV感染的检出率;3)对相同的另一份标本以本课题组的HPVL1多肽抗血清为探针进行酶联免疫吸附(ELISA)实验,确定标本中病毒L1蛋白的存在与否,计算由本方法检测HPV感染率;4)采用统计学软件,比较分析以上两种检查方法检测HPV的能力效价。 结果:1)凯普试剂盒检测308例临床标本,阴性256例,阴性率为83.11％;阳性52例,阳性率为16.89％。其中HPV6、18各2例, HPV11有4例,HPV16有11例, HPV31、33、39、59、66、68、CP8304各有1例,HPV52有5例, HPV53有3例, HPV58有6例,HPV混合型共有12例。HPV感染的型别中,HPV16、52和HPV58感染的比率均较高,分别占总有感染标本的20％、16％、14％。2)ELISA检测308例临床标本,共检出阳性48例,阳性率为15.58％,阴性标本260例,阴性率为84.42％。3)凯普和ELISA两种方法检测HPV阳性例数,进行t检验,两种检测方法阳性率无统计学意义(P>0.05)。4)52例凯普试剂盒检测阳性的标本中,ELISA检测只有42例为阳性,其中HPV11有2例,HPV16有1例,HPV39、52、53、58、68各有1例,混合型有2例用ELISA方法检测为阴性。凯普检测256例阴性标本中,ELISA检测共有250例为阴性,阳性例数6例。5)凯普和ELISA两种方法检测同时为阳性的标本有42例,同时为阴性的标本有250例,凯普阳性、ELISA阴性标本10例,凯普阴性、ELISA阳性标本6例,结果进行X2检验,两种方法阳性率无统计学意义(P>0.05)。结论:1)用ELISA方法检测HPVL1蛋白的表达,能够确定是否有HPV的感染,与凯普HPV分型试剂盒检测HPV感染具有相同的检测效果;2)本课题组制备的HPVL1多肽抗体对多种型别HPVL1具有广谱反应能力和良好检测能力。 第二部分:HPVL1多肽抗血清中和HPV16能力确证 目的:以HPV16作为研究的靶物质,判断该序列多肽抗血清是否具有中和HPV病毒的作用,判断是否具有针对HPV感染的免疫保护潜能,从而进一步确证多肽血清中和能力的多样性,为HPV疫苗的开发、研究做理论基础。 方法:1)收集经过临床病理诊断的宫颈癌标本,PCR法对其进行HPV分型;2)通过对宫颈癌组织进行匀浆、离心、浓缩,微孔滤膜过滤除菌后,提取HPV16病毒混悬液;3)将提取的病毒混悬液与倍比稀释后的多肽抗血清共孵育中和后,感染单层培养的HaCat细胞,用PCR方法检测感染后HaCat细胞中是否有HPV16-DNA的存在;4)用ELISA法检测感染后HaCat细胞HPVL1蛋白的表达差异情况,判定HPV L1多肽抗血清是否可以阻断HPV16对HaCat上皮细胞的感染,从而间接反应多肽抗血清中和HPV16的能力。 结果:1)提取宫颈癌病变组织细胞的DNA,进行PCR产物经电泳,在凝胶206bp处(HPV16特异性区间)呈阳性条带;2)粗提的HPV病毒感染正常的HaCat细胞,其细胞DNA提取物的PCR产物经电泳,在凝胶206bp处呈阳性条带;3)HPV病毒与不同稀释浓度的多肽抗血清中和后感染HaCat细胞,提取细胞的蛋白进行ELISA检测HPVL1蛋白的表达,结果显示其含量呈梯度变化趋势,随着多肽抗血清浓度的增加,L1蛋白的含量降低,变化的差异具有统计学意义。 结论:1)可以从宫颈癌病变的组织中,粗提取HPV16型病毒;2)粗提取的HPV病毒能够感染正常的HaCat细胞;3)初步证明HPV L1多肽抗血清具有抑制HPV16病毒对HaCat细胞吸附的能力,抑制能力与抗血清浓度成正比。本实验初步表明:HPVL1多肽抗血清具有一定的针对HPV16病毒的中和作用。