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类黄酮是一类广泛存在于植物中的次生代谢物质。类黄酮参与植物的生长发育、植物花和果实的着色反应,植物的抗逆反应等。查尔酮合成酶(Chalconesynthase,CHS)基因是类黄酮合成途径的第一个关键酶基因,在类黄酮合成中起重要的调控作用,然而目前对CHS基因在调控类黄酮合成代谢中的作用机制还不明确。前人在对拟南芥的研究中发现,第四亚组R2R3MYB类转录因子负调控类黄酮代谢途径,但在烟草中尚未见报道。烟草作为高等植物基因工程(转基因)研究的模式植物,在基因功能研究中发挥重要作用。本研究利用转基因技术,从关键酶CHS基因和R2R3 MYB类转录抑制因子两个方面同时入手,通过构建CHS基因和R2R3MYB转录抑制因子的表达载体,转化烟草并获得转基因植株,分析CHS基因和R2R3MYB转录抑制因子基因的表达调控对类黄酮合成代谢的影响,以期探讨它们在模式植物烟草中调控类黄酮合成代谢的作用机理。从分子水平上探讨烟草等作物高品质、抗逆的分子机理,为功能基因定位、基因工程辅助育种的应用提供理论依据。同时利用转基因手段获得高品质、高抗性的烟草等作物新品系,为培育高产、优质、高抗的作物品种以及作物品质分子育种开辟新途径。其主要研究结果如下:1.在普通烟草红花大金元中克隆到7个NtCHS基因,命名为INtCHS1-NtCHS7。序列分析及表达模式分析发现,普通烟草7个NtCHS基因家族成员具有如下具体特征:(1)普通烟草NtCHS1-NtCHS7基因序列之间以及与其他植物CHS基因具有较高的序列同源性。NtCHS1-NtCHS7含有其它植物CHS所含有的典型的活性位点,NtCHS5-NtCHS7在相对保守的某些活性位点中存在变异,而NtCHS1-NtCHS4在这些位点不存在变异。(2)普通烟草7个NtCHS基因家族成员的系统进化关系表现出两个特征:一是普通烟草NtCHS基因家族成员分为三个不同的亚组,NtCHS1-NtCHS4与植物典型CHS基因聚在一个亚组;NtCHS5和NtCHS6与CHS-like基因聚在一个亚组;NtCHS7与NtCHS1-NtCHS6的进化关系较远,NtCHS7与报道的一个未知功能的番茄CHS基因聚在另一个亚组。二是茄科植物的CHS基因在物种分化以前就已经分化。(3)普通烟草NtCHS1-NtCHS7存在时空和组织特异性表达。NtCHS1-NtCHS4在营养器官和花器官中高表达,NtCHS5在盛花期的花冠和花萼中高表达,NtCHS7在花蕾期的花萼中特异性高表达,而NtCHS6在各组织各时期均微量表达。(4)普通烟草NtCHS1-NtCHS7受非生物胁迫诱导表达模式各异。在NtCHS1和NtCHS3受干旱和盐胁迫诱导高度表达,NtCHS2和NtCHS4受外源ABA和MeJA诱导高度表达,NtCHS4受2,4-D诱导特异表达。NtCHS6受光照、干旱和盐胁迫诱导表达,NtCHS5和NtCHS7不受上述胁迫的诱导。2.为明确CHS基因在烟草类黄酮代谢途径中的作用,本研究分析了 NtCHS1基因调控表达后对类黄酮合成代谢产物合成的影响作用。研究结果发现:(1)NtCHS1基因参与调控烟草叶片中总黄酮、绿原酸、芸香苷、花青素、原花青素等化合物的合成。NtCHS1基因过量表达引起烟草叶片中上述物质含量的显著增加;其沉默表达引起上述物质的含量显著降低。与此同时还影响了花的生长发育,花托和花柱的长度明显减小,柱头的发育畸形。(2)NtCHS1基因沉默表达明显增强了转基因烟草对黄瓜花叶病毒病(CMV)的抗性。NtCHS1基因沉默的转基因烟草通过增加原花青素、咖啡酸、绿原酸等抗病毒物质抑制病毒侵染。同时通过诱导植物产生抗病相关基因PAL、PR1、LOX3等的表达,增加抗氧化酶SOD、POD的活性,诱导激活水杨酸代谢信号途径和茉莉酸甲脂信号途径等多管齐下的方式,对CMV病毒产生诱导抗性。(3)NtCHS1基因过量表达显著增强了转基因烟草对盐胁迫的耐受能力。过量表达NtCHS1基因能够引起植物体内绿原酸和芸香苷两种抗氧化能力较强的类黄酮化合物的积累,提高SOD、CAT等氧化酶活性,减轻盐胁迫对植物细胞产生的氧化胁迫伤害,从而提高转基因烟草对高盐胁迫的耐受能力。3.利用同源克隆的方法,本研究克隆获得NtMYB2,4三个MYB转录抑制因子基因。NtMYB1,2,4含有R2R3 MYB类转录因子的保守结构域[D/E]Lx2[R/K]x3Lx6LX3R 和 LlsrGIDPxT/SHRxI/L,以及第四亚组 MYB 转录抑制因子特有抑制基序pdLNLD/ElxiG/S和锌指结构域CX1-2CX7-12CX2C。说明NtMYB1,2,4基因为R2R3MYB类转录抑制因子。研究结果表明:(1)NtMYB1,NtMYB2和NtMYB4具有时空特异表达的特性。NtMYB1,2,4基因在花器官中的表达量显著高于在营养器官中的表达量,甚至高达数百倍。NtMYB4的表达量占主导地位,在各个器官和组织的表达量高于NtMYB1和NtMYB2。此外,NtMYB1,NtMYB2和NtMYB4受黑暗胁迫诱导表达,NtMYB4受高盐胁迫(200 mM)和干旱诱导表达。(2)NtMYB1,NtMYB2和NtMYB4间在表达水平上存在相互调控的关系。NtMYB1和NtMYB2,NtMYB1和NtMYB4间可能存在协同作用,而NtMYB2和NtMYB4间可能存在互补作用。(3)NtMYB1,NtMYB2和NtMYB4与类黄酮途径结构基因间在表达水平上存在相互调控关系。NtMYB1,NtMYB2和NtMYB4的过量表达显著抑制了 PAL,CHS,ANR1基因的表达。4CL和F3H的表达量受NtMYB1和NtMYB2的过量表达诱导而受NtMYB4的过量表达显著抑制。DFR,FLS的表达量受NtMYB1和NtMYB2的过量表达抑制而受NtMYB4的过量表达显著诱导。(4)NtMYB1,NtMYB2和NtMYB4对烟草类黄酮代谢途径起负调控作用。NtMYB1,2,4基因的过量表达均抑制了苯丙烷合成和类黄酮合成途径产物总黄酮、咖啡酸、绿原酸、隐绿原酸以及芸香苷的积累。NtMYB1,2,4可能与从bHLH类转录因子之间存在互作关系。说明NtMYB1、NtMYB2、NtMYB4基因可能通过调控bHLH类转录因子的表达,负调控烟草类黄酮合成代谢途径,从而抑制类黄酮化合物的产生和积累。