论文部分内容阅读
赖氨酸是人体和动物非自身合成的第一限制性氨基酸,被广泛用作饲料、食品和饮料行业的营养添加剂,也可作为化学中间体。2016年赖氨酸产能约为230万吨,且每年仍以约7%的速率增长。据估计到2020年赖氨酸的产能将突破300万吨。在目前赖氨酸产能过剩的情况下,通过菌株选育,发酵工艺优化进一步降低赖氨酸的生产成本,同时将赖氨酸转化为可用于活性药物中间体、药物或生物基聚合材料的高附加值化学品,可以维持赖氨酸市场和开拓赖氨酸产业链。本课题以产能过剩的大宗化学品L-赖氨酸为原料,以代谢工程和合成生物学为手段,开展赖氨酸下游高附加值衍生化学品生物合成的菌种和工艺研究。发酵、酶催化或全细胞催化L-赖氨酸生产5-氨基戊酸,6-氨基己酸和7-氨基庚酸等一系列新型生物基聚合材料单体和L-哌啶甲酸等生物医药中间体,有利于维持赖氨酸市场,进一步开拓赖氨酸产业链。这些绿色生物制造策略也可以用于提高其他氨基酸产业的竞争力。主要研究结果如下:(1)建立了L-赖氨酸,5-氨基戊酸,6-氨基己酸和7-氨基庚酸的苯异硫氰酸酯柱前衍生高效液相色谱检测方法。建立了L-哌啶甲酸的手性非衍生高效液相色谱测定法,以硫酸铜为流动相,实现了L-哌啶甲酸和R-哌啶甲酸的分离和测定。(2)建立了生物医药中间体L-哌啶甲酸的发酵生产工艺。过表达L-赖氨酸α-氧化酶RaiP,Δ1-哌啶酮-2-烯羧酸还原酶DpkA,葡萄糖脱氢酶GDH和L-赖氨酸转运蛋白LysP,建立了一锅法生产L-哌啶甲酸的代谢途径。通过研究底物种类对生产L-哌啶甲酸的影响,确定L-赖氨酸HCl作为生产L-哌啶甲酸的更优底物,可提高L-哌啶甲酸产量21.28%,可节约发酵成本16.67%。对赖氨酸降解途径中的关键酶CadA进行了敲除和过表达赖氨酸转运蛋白酶LysP,加强赖氨酸转运速率,分别可提高L-哌啶甲酸产量52.52%和49.88%。最后5-L发酵罐发酵40 h可生产46.7 g/L L-哌啶甲酸,得率为0.89 g/g。(3)建立了生物基材料单体5-氨基戊酸的生物-化学耦合生产工艺。在发酵法生产5-氨基戊酸的基础上,通过耦合化学氧化过程,建立5-氨基戊酸的生物-化学耦合生产工艺。比较底物L-赖氨酸和L-赖氨酸HCl对生产5-氨基戊酸的影响,选择L-赖氨酸HCl为更优底物。添加4%(v:v)乙醇和10 mM H2O2以10 g/L L-赖氨酸HCl为底物,菌株CJ02摇瓶发酵可生产5-氨基戊酸5.61 g/L,得率为0.56 g/g,与对照菌株相比,5-氨基戊酸的产量提高了18倍。揭示了乙醇添加提高5-氨基戊酸产量的原因是乙醇添加促进大肠杆菌外源基因L-赖氨酸α-氧化酶RaiP的可溶性蛋白表达。最后5-L发酵罐可生产29.12 g/L 5-氨基戊酸,得率为0.44 g/g。(4)建立了乙醇预处理全细胞催化剂CJ02RaiP生产5-氨基戊酸的全细胞催化工艺。在反应转化温度37 oC,pH 8.0,200 rpm,3 mM Mg2+,10 mM H2O2,100 g/L L-赖氨酸HCl分批补料的条件下,400 mL乙醇预处理的全细胞催化体系催化转化48 h后可生产50.62 g/L 5-氨基戊酸。(5)建立了人工递归碳链延伸循环-多酶级联催化系统。并利用该多酶级联催化系统同时生产一系列生物基材料单体非天然直链氨基酸5-氨基戊酸,6-氨基己酸和7-氨基庚酸。对限速酶LeuA进行了鉴定及分析,建立了关键位点H97和S139的饱和突变体库。考察了辅酶NAD+和ThDP供应对非天然直链氨基酸产量及分布的影响。该多酶级联催化系统催化反应8 h后,可同时生产99.16 mg/L 5-氨基戊酸,46.96 mg/L 6-氨基己酸,4.78 mg/L 7-氨基庚酸。