以禽网状内皮组织增生症病毒(REV)前病毒全基因cDNA克隆质粒DNA(pB101)为模板,采用PCR扩增技术,扩增出1200bp大小的env基因片段,并将其克隆到PGEX-4T-3表达载体上,经测序鉴定结果显示,成功构建了PGEX-4T-3-env表达质粒。将该质粒转化到大肠杆菌BL21中,通过IPTG诱导、SDS-PAGE检测结果显示,env基因在大肠杆菌中以包涵体的形式进行了高效表达。以尿素溶解液洗涤并溶解包涵体蛋白,4℃复性后用GST融合蛋白纯化试剂盒纯化;将纯化产物用牛凝血酶酶解切除GST标签蛋白便获得了纯env基因囊膜糖蛋白,用Western blot对该蛋白进行检测分析结果表明,env基因表达的蛋白具有良好的反应原性,能够很好的识别REV抗体。用纯化的env蛋白为包被抗原,建立了检测抗REV抗体的间接ELISA(ienv-ELISA)。经对ienv-ELISA的最佳工作条件测定结果表明,抗原最佳包被浓度为10mg/ml、血清的最佳稀释度为1:500,二抗的最佳稀释度为1:5000,最佳包被液为TB,最佳显色时间为15min。经重复性试验、特异性试验和对比试验结果显示,建立的ienv-ELISA方法有良好的可重复性,标准差均小于15%;与鸡IBDV MDV NDV AIV等病毒阳性抗体均无交叉反应;与全病毒ELISA(REV-ELISA)和IFA准确性符合率均超过90%。用纯化的env蛋白免疫Babl/c小鼠,用聚乙二醇(PEG)介导Babl/c小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合。经选择性培养、有限稀释法克隆化和纯化的env蛋白进行筛选,获得了16株能稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株(分别命名为: 0.5-2E12、3-2A11、3-2B3、3-2F3、1-2E3、3D2、1-2D8、1-2E9、1-1A4、1-2B5、1-2B4、1-2C1、1-2C2、1-2D1、1-2D11、1-2H8)。Western blot分析表明,16株杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体均能特异性的识别env蛋白;间接免疫荧光试验(IFA)检测结果显示,有6株(0.5-2E12、3-2B3、1-2E3、3D2、1-2D8、1-2H8)杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体能特异性的识别REV全病毒。将6株杂交瘤细胞注射Balb/c小鼠制备腹水,间接ELISA检测其腹水的抗体效价均超过105;将腹水蛋白进行浓缩、纯化,测定其浓度为8mg/ml。用纯化单抗建立检测REV的双抗体夹心ELISA方法,通过对该方法进行最佳工作条件优化结果表明,单抗、多抗和二抗的最佳工作浓度分别为1:1600、1:8000和1:5000、最佳包被液为CB。用该方法与几种常见的鸡的传染病病毒(IBDV MDV NDV AIV)进行特异性试验,结果均未发生交叉反应,说明该方法对REV检测具有高度特异性。重复性试验结果显示该方法具有良好的可重复性。