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第一部分shRNA-Smad3载体构建及瘢痕疙瘩成纤维细胞的培养目的:构建抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞(KFB)Smad3基因表达的shRNA真核表达载体,并转染至原代培养的瘢痕成纤维细胞中,获得最佳转染条件。方法:用前期试验筛选出的一对最有效siRNA序列重组构建Smad3 shRNA表达质粒。通过脂质体介导的方法,按不同比例,时间及浓度,通过荧光显微镜判断最佳转染条件。采用组织块贴壁法进行原代瘢痕疙瘩成纤维细胞培养。结果:经测序、凝胶电泳分析,成功构建shRNA-Smad3载体,shRNA-Smad3与脂质体比例为1:1.8,在无血清条件下,转染时间72h后转染效率最高。原代瘢痕疙瘩成纤维细胞培养成功。结论:脂质体与DNA质粒适当的比例条件下加入,在转染较短的时间内,脂质体法转染原代培养的人瘢痕疙瘩成纤维细胞可使目的基因获得较高的转染率,且细胞死亡最少。脂质体是研究原代培养的人瘢痕疙瘩成纤维细胞生物学行为较为理想的转染方法。组织块法可以得到瘢痕疙瘩成纤维细胞。第二部分shRNA-Smad3对瘢痕疙瘩成纤维细胞Smad3、COL1A2、及Smad7基因表达的影响目的:研究shRNA-Smad3对KFB转染到KFB后Smad3、Smad7及COL1A2表达的影响。方法:通过脂质体介导的方法,将shRNA-Smad3转染到瘢痕成纤维细胞,用免疫组化,RT-PCR及Western blotting的方法检测Smad3、Smad7不同时间点(0～9d)表达的变化。结果:①RT-PCR和Western blotting的结果证实Smad3 shRNA载体构建成功。②转染Smad3 shRNA后,随着时间的延长,KFB中Smad3的mRNA与蛋白表达都显著减低,到72h作用最强。光密度分析与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。Smad7的mRNA与蛋白表达都明显升高(P<0.05)。结论:转染shRNA-Smad3后,能使KFB的Smad3mRNA和蛋白水平表达受到抑制,亦使其Ⅰ型胶原mRNA和蛋白水平表达降低,Samd7的mRNA与蛋白明显升高,提示Smad3可能对Smad7起反向调节的作用。