目前认为,左室肥厚是影响原发性高血压(essential hypertension,EH)患者病残率和死亡率的—个重要的独立危险因子。因此,逆转左室肥厚已成为当前治疗EH的重要目标之一。左室肥厚的细胞病理学基础不仅表现在心肌实质细胞的肥大,还有心脏成纤维细胞(CFs)的过度增殖和细胞外基质(extracellular matrix,ECM)大量沉积,导致心肌纤维化。左心室肥厚是心血管疾病的独立危险因素,随着左心室肥厚的发生、发展,猝死、冠心病、心肌缺血、心力衰竭等心血管事件的发生率显著增加。　　 流行病学资料显示,EH左室肥厚患者的发病率和死亡率与性别显著相关,女性绝经前与同龄男性比较,EH的病夕匕率显著低于男性,而卵巢切除或绝经后的妇女心血管疾病发病率与死亡率明显增高,与同龄男性比较无显著性差异。表明EH左室肥厚的发生发展与雌激素有关。临床资料证实,在标准降压治疗基础上给予绝经后EH女胜患者17β-雌二醇(17β-estradiol,E2)可使左心室重量进一步降低,提示E2可能具有逆转左室肥厚的作用。　　 现已证明,雌激素对心血管系统具有保护效应,可以通过调节血脂、调节血压、对心脏的直接作用,以及触发一些心脏保护因子的释放等来抑制多种刺激因素所致的心肌肥大反应。雌激素的效应是由雌激素受体(estrogen receptor,ER)介导的,ER的存在是E2发挥效应的物质基础。心血管系统存在着雌激素受体,雌激素在与ER结合后,可以通过基因效应和非基因效应调节细胞内的信号转导,影响靶基因的转录,调节功能蛋白的合成,从而发挥多种生物学效应。如改善血脂代谢,抑制动脉粥样硬化的发生发展,抑制血管平滑肌细胞的增殖,促进血管内皮损伤的修复等。而丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activatedprotein kinases,MAPKs)信号,G蛋白、酪氨酸激酶、P13K/Akt信号等信号途径可能参与了雌激素的效应。那么在雌激素对高血压及其引起的心肌肥大有什么影响?是不是可以抑制高血压引起的心肌肥大呢?且ERK2/1和Akt信号在其中有什么作用?目前还未完全明了　　 近年来,许多研究表明细胞质膜微囊(caveolae)在多条信号转导途径中起枢纽作用,其标志性结构蛋白微囊蛋白(caveolin)可对许多关键信号分子的活性状态起着直接的调节作用,在心血管系统中发挥着重要的作用。本实验室以往的研究已经证实了caveolin-1能够抑制血管平滑朋细胞(vascular smooth muscle cell,VSMC)的增殖,雌激素可以通过促进caveolin-1的表达发挥血管保护作用,抑制ERK1/2的活化,调节NOS的活性。那么caveolin是否参与了雌激素对心脏的保护效应,在其发挥什么作用呢?　　 综上所述,本课题从研究caveolin入手,探讨了雌激素对压力超负荷心肌肥大的影响,通过腹主动脉缩窄建立去势雌性大鼠压力超负荷动物模型,分别给予雌激素和安慰剂,通过子宫大小判断模型建立是否成功；通过超声心动图检测大鼠心脏功能及心肌肥大情况；取组织做石蜡切片,HE染色观察心肌肥大情况；免疫印迹方法探讨整体情况下雌激素对压力超负荷时信号蛋白表达的影响；培养新生SD大鼠心肌细胞,用AngⅡ刺激其发生吧大反应,采用Bradford法、同位素法、免疫印迹等技术,检测雌激素对心肌细胞肥大的影响,观察ERK1/2、P13K/Akt通路在其中的作用,探讨caveolin-3是否是其关键分子,及雌激素对其的影响。从整体、细胞、分子水平分别研究17β-雌二醇对压力超负荷导致的心脏肥大的影响,探讨caveolin在雌激素心脏保护效应中作用,以加深对雌激素生物效应及其作用的分子机制的认识,为临床高血压心脏病的防治提供新的思路。　　 本论文主要包括以下三个部分:　　 第1章:17β-雌二醇对去势高血压大鼠心肌肥大的影响　　 第2章:ERK1/2和Akt信号在17β-雌二醇抑制AngⅡ诱导的大鼠心肌细胞肥大反应中的作用　　 第3章:微囊蛋白-3在17β-雌二醇抑制AngⅡ诱导的大鼠心肌细胞肥大反应中的作用　　 第1章:17β-雌二醇对去势高血压大鼠心肌肥大的影响　　 本章重点讨论卵巢切除雌性SD大鼠,给予17β-雌二醇对腹主动脉缩窄引起的血压升高、心功能改变和心肌肥大的影响。150g～200g雌性SD雌性大鼠140只,卵巢切除后随机分成:假手术组(sham)和腹主动脉缩窄(abdominal aorta constriction,AAC)组。Sham组又随机分为雌激素组(E2)和安慰剂组(placebo,P),AAC组也随机分为雌激素组(E2)和安慰剂组(placebo,P)。术后恢复1周,雌激素补充治疗组(E2组)补充17β-雌二醇20μg/kg/d,安慰剂组(P组)给予溶剂对照,8周后做超声心动图检测后处死,取子宫和心脏组织。　　 1.1去势及给予E2对大鼠子宫重量的影响　　 术后8周,安慰剂组与雌激素替代组比较,AAC和sham组子宫分别缩小(83.61±3.5)％(OVX+AAC+P vs OVX+AAC+E2,P<0.05)和(83.06±1.75)％(OVX+sham+P vsOVX+sham+E2,P<0.05)。　　 1.2 HE常规染色　　 HE染色见OVX+sham组心肌细胞呈梭形,核清蓝色,肌纤维呈深红色,胞浆淡红色。腹主动脉缩窄使左室心室肌细胞横径(LVTDM)分别增加(24.08±6.52)％,(OVX+AAC+E2vs OVX+sham+E2组,P<0.05),(41.64±3.75)％(OVX+AAC+P vs OVX+sham+P组,P<0.05)。腹主动脉缩窄术后,给予E2和给予安慰剂比较,左室心室肌细胞横径(LVTDM)减少(23.4±3.75)％(OVX+AAC+E2 vs OVX+AAC+P组,P<0.05)。而假手术组,给予雌激素组与安慰剂组比较左室心室叽细胞横径(LVTDM)无明显差异,(OVX+sham+E2vs OVX+sham+P组,P>0.05)。　　 1.3心脏/体重比值和大鼠超声心动图　　 与假手术组比较,AAC术后心脏/体重比值显著增加,P<0.05。而在AAC组,给与雌激素与给与安慰剂组比较,安慰剂组心脏/体重比值增加较给予雌激素组明显,P<0.05。　　 AAC组术后8周IVSd、LVSs较sham组,明显增厚,P<0.05。FS、EF较术前明显减低,P<0.05。而E2可抑制FS、EF的减少P<0.05。　　 1.4免疫印迹检测心脏组织ERK1/2的活性　　 AAC可以大鼠心脏组织中的ERK1/2活性增加(AAC VS sham P<0.05)。在AAC组给予E2可以抑制ERK1/2活性的增加,与安慰剂组比较,E2可以使ERK1/2活性降低(32.84±1.61)％(OVX+AAC+E2 vs OVX+AAC+P组,P<0.05)。而sham组磷酸化ERK1/2表达的变化无统计学意义。　　 1.5免疫印迹检测心脏组织Akt的活性　　 AAC组大鼠心脏组织中的磷酸化Akt增加(AAC VS sham,P<0.05)。在AAC组给予E2可以抑制磷酸化Akt的增加,与安慰剂组比较,给予E2可以使Akt瞵酸化降低(39.46±6.24)％(AAC+E2 vs AAC+P组,P<0.05)。而sham组磷酸化Akt表达的变化无统计学意义。　　 1.6免疫印迹检测心脏组织caveolin-3的表达　　 Caveolin-3是心肌细胞caveolae的标志蛋白。与假手术组比较AAC可以使caveolin-3表达下降(AAC VS sham P<0.05)。在AAC细给予E2能使之增加,与安慰剂组比较,给予E2可以使aveolin-3增加(26.11±7.3)％(AAC+E2 vs AAC+P组,P<0.05)。在sham组caveolin-3的变化无统计学意义。　　 小结:　　 1.在去势雌性SD大鼠腹主动脉缩窄模型中可以观察到心肌肥大,ERK1/2和Akt活性的增加及caveolin-3表达减少。　　 2.给予雌激素可以抑制心肌肥大,抑制ERK1/2和Akt的活化及caveolin-3表达的减少。　　 3.在去势雌性SD大鼠腹主动脉缩窄模型给予雌激素可能是通过促进caveolin-3表达抑制ERK1/2和Akt活性的增加,进而抑制心肌肥大。　　 第2章:ERK1/2和Akt信号在17β-雌二醇抑制AngⅡ诱导的大鼠心肌细胞肥大反应中的作用　　 本章主要在体外培养的新生大鼠心肌细胞探讨了17β-雌二醇对AngⅡ诱导的心肌细胞肥大反应的影响。　　 2.1心肌细胞活性测定　　 细胞活力=活细胞总数/(活细胞总数+死细胞总数),本实验中细胞活力在95％以上。　　 2.2心肌细胞的形态和鉴定　　 用胰酶消化分离的新生SD大鼠肌细胞在培养4～24h后,在倒置显微镜下可观察到心肌细胞开始贴壁生长,初呈圆形,后为梭形,偶见单个细胞开始搏动,继而细胞逐渐在瓶壁表面铺展,形成不规则的星形,并伸出伪足,48h后形成细胞单层或细胞簇,呈放射状排列的同心圆状,其搏动同步化,在含10％小牛血清的DMEM培养液中,搏动频率约为80～150次/min,不同细胞簇的搏动频率可有不同,在培养过程中,随着细胞间逐渐融合,亦可见整瓶心肌细胞的同步化搏动。用抗大鼠α-sacomericactin抗体,SABC免疫组化法进行鉴定,胞浆内有棕黄色颗粒者为阳性。鉴定结果显示培养细胞阳性率达90％以上,表明细胞纯度已经达到实验要求。　　 2.3 E2对AngⅡ作用于心肌细胞48小时后心肌细胞蛋白质含量的影响　　 10-7mol/L的AngⅡ作用48小时诱导蝴胞蛋白含量增加(54.81±6.45)％(vs control组,P<0.05),17β-雌二醇可以抑制AngⅡ诱导的心肌细胞蛋白质含量的增加。10-12mol/L、10-10mol/L、10-8mol/L E2分别使AngⅡ诱导的心肌细胞蛋白质含量的增加下降(12.03±4.21)％,(15.99±5.67)％,(21.47±7.1)％(vs AngⅡ组),单独使用10-8mol/L的17β-雌二醇对心肌细胞蛋白含量没有显著影响。　　 10-8mol/L的17β-雌二醇分别作用4,12,24小时可使10-7mol/L的AngⅡ诱导的心肌细胞蛋白含量增加减少(11.74±5.43)％,(17.64±4.45)％,(25.68±7.44)％(vs AngⅡ组,P<0.05)。　　 2.4 E2对AngⅡ作用心肌细胞48小时对心肌细胞表面积的影响　　 10-7mol/L的AngⅡ诱导心肌细胞表面积增加(48.98±2.23)％(vs control组,P<0.05),17β-雌二醇可以抑制AngⅡ诱导的心肌细胞表面积的增加。10-12mol/L、10-10mol/L、10-8mol/L E2分别使AngⅡ诱导的心肌细胞表面积的增加下降(9.42±1.88)％(14.98±4.89)％,(22.10±4.78)％(vs AngⅡ组),单独使用10-8mol/L雌激素对心肌细胞表面积没有显著影响。　　 10-8mol/L的17β-雌二醇分别作用4,12,24小时可以使10-7mol/L的AngⅡ诱导的心肌细胞表面积增加减少(12.66±1.88)％,(19.61±4.89)％,(24.63±4.78)％(vs AngⅡ组)。　　 2.5 E2对AngⅡ作用于心肌细胞48小时后[3H]-亮氨酸掺入的影响　　 10-7mol/L的AngⅡ诱导心肌细胞[3H]-亮氨酸掺入增加(85.62±11.62)％(vs control组,P<0.05),17β-雌二醇可以抑制AngⅡ诱导的心肌细胞[3H]-亮氨酸掺入的增加。10-12mol/L、10-10mol/L、10-8mol/L E2分别使AngⅡ诱导的心肌细胞[3H]-亮酸掺入增加下降(10.73±3.38)％(14.64±6.7)％(20.63±9.76)％(vs AngⅡ组),单独使用10-8mol/L的17β-雌二醇对心肌细胞[3H]-亮氨酸掺入没有显著影响。　　 10-8mol/L的17β-雌二醇作用4,12,24小时可以分别使10-7mol/L的AngⅡ诱导的心朋细胞[3H]-亮氨酸掺入增加减少(9.34±9.03)％,(16.65±13.59)％,(24.59±8.66)％(vsAmgⅡ组)。　　 2.6雌激素受体拮抗剂Tamoxifen(Ta)对E2抑制心肌肥大的影响　　 与对照组相比,10-7mol/L AngⅡ可使心肌细胞蛋白合成增加(60.72±8.17)％(vs control组,P<0.05)；该作用可被10-8mol/L E2预处理24h后明显抑制,抑制率为(21.19±9.66)％(vs AngⅡ组,P<0.05)；预先给予10-6mol/L Ta作用30mins,可部分抑制E2降低AngⅡ诱导的心肌细胞蛋白合成增加的作用,抑制率为(24.24±7.26)％(vs E2+AngⅡ组,P<0.05)；AngⅡ组与AngⅡ+E2+Ta组之间无显著性差异(P>0.05)；单独给予Ta对心肌细胞蛋白合成没有显著影响(vs control组,P>0.05)。　　 与对照组相比,10-7mol/L AngⅡ可使心肌细胞[3H]-亮氨酸掺入增加(67.18±10.06)％(vs control组,P<0.05)；该作用可被10-8mol/L E2预处理24h后明显抑制,抑制率为(21.85±7.09)％(vs AngⅡ组,P<0.05)；预先给予10-6mol/L Ta作用30mins,可部分抑制E2降低AngⅡ诱导的心肌细胞[3H]-亮氨酸掺入增加的作用,抑制率为(25.01±11.89)％(vs E2+AngⅡ组,P<0.05)；AngⅡ组与AngⅡ+E2+Ta组之间无显著性差异(P>0.05)；单独给予Ta对心肌细胞[3H]-亮氨酸掺入没有显著影响(vs control组,P>0.05)。　　 2.7 ERK1/2信号转导途径在E2抑制心肌细胞肥大中的变化　　 2.7.1 E2对心肌细胞肥大反应中ERK1/2活性的影响　　 与对照组比较,10-7mol/L AngⅡ能使蝴胞的磷酸化ERK1/2增加(177.12±14.6)％(vs control组,P<0.05),预先给予10-8mol/L E2使AngⅡ诱导的心肌细胞ERK1/2活性增加降低(vs AngⅡ组,P<0.05),ER拮抗剂Ta预处理30mins可逆转E2对AngⅡ诱导的心肌细胞ERK1/2活性增加的抑制作用(vs E2组,P<0.05),单独给予E2和Ta对ERK1/2磷酸化无显著影响(vs control组,P>0.05)。　　 2.7.2 PD98059对E2抑制AngⅡ诱导的心肌细胞肥大反应的影响　　 与对照组相比,10-7mol/L AngⅡ可使心肌细胞[3H]-亮氨酸掺入增加(70.82±8.37)％(vscontrol组,P<0.05)；10-8mol/L E2预处理24h使AngⅡ诱导的心肌细胞[3H]-亮氨酸掺入减少,其抑制率为(20.8±9.97)％(vs AngⅡ组,P<0.05)；PD98059(50μmol/L)预处理1h可以抑制E2使AngⅡ诱导的心肌细胞[3H]-亮氨酸掺入减少的作用,其抑制率为(28.74±8.7)％(vs AngⅡ组,P<0.05)。　　 2.73 E2对心肌细胞肥大反应时MKP-1蛋白表达的影响　　 10-7mol/L AngⅡ作用可增加心肌细胞MKP-1蛋白的表达增加(vs control组,P<0.05),事先用E2预处理,可以加强AngⅡ促进MKP-1蛋白表达增加的作用(vs AngⅡ组,P<0.05)。单独给予E2对MKP-1表达无明显影响(vs control组,P>0.05)。　　 2.8 P13K/Akt信号转导途径在E2抑制心肌细胞肥大中的变化　　 2.8.1 E2对心肌细胞肥大反应中Akt活性的影响　　 与对照组比较,10-7mol/L AngⅡ能使心肌细胞的磷酸化Akt增加(140.7±5.69)％(vscontrol组,P<0.05),给予10-8mol/L E2预处理使AngⅡ诱导的心肌细胞磷酸化Akt增加降低了(41.82±4.13)％(vs AngⅡ组,P<0.05),ER拮抗剂Ta预处理30mins可逆转E2抑制AngⅡ诱导的心肌细胞磷酸化Akt增加的作用(vs E2组,P<0.05),提示E2抑制AngⅡ诱导的Akt磷酸化噌加的作用至少部分是通过ER介导的。而单独始予E2对Akt磷酸化无明显影响(vs control组,P>0.05)。　　 2.8.2 LY294002对E2抑制AngⅡ诱导的心肌细胞肥大反应的影响　　 与对照组相比,10-7mol/L AngⅡ可使心肌细胞[3H]-亮氨酸掺入增加(73.93±11.31)％(vs control组,P<0.05)；10-8mol/L E2预处理24h使AngⅡ诱导的心肌细胞[3H]-亮氨酸掺入减少(21.21±10.21)％(vs AngⅡ组,P<0.05)；LY294002使E2对AngⅡ诱导的心肌细胞[3H]-亮氨酸掺入增加的抑制作用加强,抑制率为(30.06±7.06)％(vs AngⅡ组,P<0.05),提示Akt的激活参与了AngⅡ诱导的心肌细胞肥大反应,而E2可通过抑制Akt的激活从而抑制AngⅡ诱导的心肌细胞肥大反应。　　 小结:　　 1.在体外培养的新生大鼠心肌细胞,雌激素可以抑制AngⅡ诱导的蛋白合成增加、细胞表面积增大和[3H]-亮氨酸掺入增加。　　 2.在体外培养的新生大鼠心肌细胞,雌激素可以抑制AngⅡ诱导的磷酸化ERK1/2增加,促进MKP-1的表达。雌激素通过促进MKP-1表达抑制磷酸化ERK1/2增加进而抑制AngⅡ诱导的心肌细胞肥大反应。　　 3.在体外培养的新生大鼠心肌细胞,雌激素可以抑制AngⅡ诱导的磷酸化Akt的增加。雌激素可以通过抑制磷酸化Akt的增加发挥效应。　　 第3章:微囊蛋白-3在17β-雌二醇抑制AngⅡ诱导的大鼠心肌细胞肥大反应中的作用　　 在原代培养的新生SD大鼠心肌细胞,用AngⅡ诱导发生肥大反应,观察caveolin-3在雌激素抑制心肌细胞肥大反应中的作用。　　 3.1 E2抑制心肌细胞肥大过程中caveolin-3表达的变化　　 10-7mol/L AngⅡ可明显降低caveolin-3蛋白的表达(Vs control组,P<0.05),提前用17β-雌二醇预处理细胞,可显著增加AngⅡ作用后caveolin-3蛋白表达(vs AngⅡ组,P<0.05)。用了雌激素受体抑制剂Ta提前孵育细胞30mins,可以抑制E2的作用,caveolin-3蛋白表达下降(vs E2+AngⅡ,P<0.05,),而单独给予E2对caveolin-3的表达没有影响。　　 3.2 caveolin阻断剂M-β-CD对E2抑制AngⅡ诱导的心肌细胞肥大反应的影响　　 与对照组相比,10-7mol/L AngⅡ可使心肌细胞[3H]-亮氨酸掺入增加(74.37±8.2)％(vscontrol组,P<0.05)；10-8mol/L E2预处理24h使AngⅡ诱导的心肌细胞[3H]-亮氨酸掺入减少(43.58±5.48)％(vs AngⅡ组,P<0.05)；M-β-CD(10-3mol/L)预处理心肌细胞2h,使E2对AngⅡ诱导的心肌细胞肥大反应的抑制作用减弱(vs E2+AngⅡ组,P<0.05)。　　 3.3 caveolin阻断剂M-β-CD对E2调节磷酸化ERK1/2效应的影响　　 为了探讨caveolin-3在E2调节磷酸化ERK1/2蛋白表达过程中的作用,我们使用了caveolin阻断剂M-β-CD(10-3mol/L)预处理心肌细胞2h,可逆转17β-雌二醇抑制AngⅡ诱导的ERK1/2磷酸化的效应。　　 3.4 caveolin阻断剂M-β-CD对E2调节磷酸化Akt效应的影响　　 为了探讨caveolin-3在E2调节磷酸化Akt蛋白表达过程中的作用,我们使用了caveolin阻断剂M-β-CD(10-3mol/L)预处理心肌细胞2h,可逆转17β-雌二醇抑制AngⅡ诱导的Akt磷酸化的效应。　　 小结:雌激素可以通过促进caveolin-3的表达抑制AngⅡ诱导的ERK1/2和Akt活性增加,进而抑制AngⅡ诱导的心肌细胞肥大。　　 结论:　　 1.在去势雌性SD大鼠腹主动脉缩窄模型中可以观察到压力超负荷引起的心肌肥大,ERK1/2和Akt活性的增加及caveolin-3表达减少。雌激素可以抑制压力超负荷导致的心肌肥大,可能是通过促进caveolin-3表达,抑制ERK1/2和Akt磷酸化,进而抑制心肌肥大的。　　 2.在体外培养的新生大鼠心肌细胞,AngⅡ可以诱导心肌细胞发生肥大反应。雌激素可以抑制AngⅡ诱导的心肌细胞肥大反应,雌激素可能是通过促进caveolin-3的表达,抑制AngⅡ诱导的心肌细胞ERK1/2和Akc磷酸化,进而抑制AngⅡ诱导的心肌细胞肥大的。