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为了有效减少细菌的抗药性,促进对感染细胞内细菌有效清除,尤其是针对革兰阴性菌感染,研究对抗内毒素特异有效的制剂。本实验利用①人体免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus HIV)的逆转录因子(trans-activator TAT)蛋白的功能-促进HIV病毒进入分裂或未分裂细胞；②巨细胞病毒(Humancytomegalovirus HCMV)严格的细胞嗜性-特异性与单核巨噬细胞结合。拟将HCMV结合受体膜糖蛋白gB中保守基因AD1及具有泛嗜性TAT蛋白与BPI基因融合表达,旨在赋予修饰后BPI一个新的功能:可以高效率穿透细胞膜或者多种屏障,如血脑屏障或菌膜,同时利用巨噬细胞的导向作用使融合蛋白具有中和不同解剖分布状态的LPS的功能,结果在于①对LPS-LBP、LPS-HDL有中和作用,具有延时保护效果；②细胞内感染细菌有清除作用,预防感染的复发；③中和活性较单纯BPI进一步提高；④提高BPI的渗透作用,有利于治疗各种难治性感染；⑤改变普通抗生素的作用机制,减少细菌产生抗药性,从而为临床脓毒症及败血症、内毒素血症等的治疗找到一条新的有效途径。
目的:为使BPI能高效率穿透细胞膜或多种屏障,中和不同解剖部位的LPS,构建TAT-BPI-gB原核表达载体并鉴定,为研制以BPI为基础的多肽抗生素打下基础。
方法：
1.BPI cDNA片段的扩增:PMN提取,Trizol提取细胞总RNA,将RNA转录为cDNA,利用特异性BPI引物进行PCR得到BPIDNA片段。
2.pUC57-TAT-BPI重组质粒的构建:将人工合成的TAT互补单链混合,得到双链片段。将TAT双链片段经PaeⅠ、SalⅠ双酶切后,与pUC57载体连接,构建pUC57-TAT重组质粒。将PCR扩增得到的BPI片段用SalⅠ、KpnⅠ双酶切后,与重组质粒pUC57-TAT连接,电转化感受态细菌DH5α,提取质粒并鉴定。
3.gB DNA片段的扩增:依据Genebank中GQ166969提供的UL55基因序列,人工合成人巨细胞病毒糖蛋白gB的UL55编码中AD1序列,利用gB引物进行PCR扩增得到该DNA片段。
4.pUC57-TAT-BPI-gB融合蛋白载体的构建:将PCR扩增得到的gB片段用KpnⅠ、EcoRⅠ双酶切后,与重组质粒pUC57-TAT-BPI连接,电转化感受态细菌DH5α,提取质粒并酶切及测序鉴定。
5.同源性分析:应用计算机blast软件将重组蛋白TAT-BPI-gB与Genebank中TAT(YGRKKRRQRRR)序列、gB序列UL55(28个氨基酸)和BPI全序列AF322588中N端(1-597基因片段)等参照序列进行同源性分析比较。
结果：1％琼脂糖凝胶电泳显示BPI基因大小约600bp、ga基因约80bp。pUC57-TAT-BPI和pUC57-TAT-BPI-gB重组质粒经PCR和酶切鉴定,1％琼脂糖凝胶电泳结果显示条带在600bp和700bp左右。同源性分析TAT序列中,第10,30位核苷酸有突变,核苷酸同源性为93％,氨基酸同源性为90％；在BPI序列中,234,454,495,556位核苷酸有突变,核苷酸同源性为98％,氨基酸同源性为95％；在ga序列中,15,27,36,43,53,61,74位核苷酸有突变,核苷酸同源性为91％,氨基酸同源性为93％。
结论：
1.从肺炎患者中性粒细胞中,利用逆转录PCR技术扩增出BPIN端基因片段。
2.将TAT、BPI基因片段克隆到pUC57载体中,并进行PCR、酶切及DNA序列分析鉴定,成功构建了TAT-BPI融合蛋白的原核表达载体。
3.将gB基因片段克隆到pTAT-BPI载体中,并进行PCR、酶切及DNA序列分析鉴定,成功构建了TAT-BPI-gB融合蛋白的原核表达载体,为进一步研究BPI的抗菌作用奠定了基础。