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研究背景:多发性硬化(multiple sclerosis,MS)是一种主要累及脑和脊髓的中枢神经系统(central nervous system,CNS)自身免疫性疾病。视神经脊髓炎(neuromyelitis optica,NMO)是一种主要累及视神经和脊髓的CNS自身免疫性疾病。视神经脊髓炎谱系疾病(neuromyelitis optica spectrum disorders,NMOSD)是NMO相关疾病。MS和NMO/NMOSD都易复发,致残率高,严重影响患者的身心健康,增加家庭和社会的负担。MS和NMO/NMOSD的发病机制尚未完全明确,目前没有特异性的治疗方法。因此对疾病的发病进行深入的研究及寻找新的治疗靶点尤为重要。MS被认为是自身反应性T细胞介导的自身免疫性疾病,体液免疫反应也参与疾病的发生。NMO/NMOSD是体液免疫为主的复杂的自身免疫性疾病,T细胞也参与疾病的发病。细胞免疫和体液免疫均参与MS和NMO/NMOSD的发病。但是T细胞是如何调控疾病发病过程中的体液免疫反应仍不清楚。滤泡辅助性T细胞(follicular helper T cells,Tfh cells)是参与体液免疫反应的辅助性T细胞。它能够在生发中心(germinal center,GC)辅助B细胞分化成记忆性B细胞和浆细胞,参与抗体的产生。Tfh细胞的功能出现异常,导致系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus,SLE)、类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis,RA)、重症肌无力(myasthenia gravis,MG)等自身免疫性疾病。外周循环中也存在Tfh细胞,与GC Tfh细胞具有相似的表型和功能特性。大部分外周循环中的Tfh细胞是记忆性的Tfh细胞。免疫记忆是获得性免疫反应的标志。在初次免疫反应以后,大部分效应性T细胞凋亡,只有一小部分T细胞存活并成为记忆性T细胞。当抗原再次入侵时,这些记忆性T细胞诱导一个快速有效的二次免疫反应,参与自身免疫性疾病的复发、超敏反应和疫苗接种后的免疫反应。目前仍不清楚在MS和NMO//NMOSD发病过程中,记忆性Tfh细胞的表达和功能情况是否发生变化。我们以此为切入点,深入研究外周循环中的记忆性Tfh细胞在MS和NMO/NMOSD发病中所发挥的重要作用。研究目的和意义:通过研究MS和NMO/NMOSD患者外周循环中的记忆性Tfh细胞及其不同亚型的表达,记忆性Tfh细胞的功能,以及激素治疗对记忆性Tfh细胞的作用,探讨记忆性Tfh细胞在疾病发病中的作用。研究方法:应用流式细胞仪检测正常对照组(healthy controls,HC)、MS组和NMO/NMOSD组患者治疗前、后外周循环中的记忆性Tfh细胞及其不同亚型的表达;用ELISA技术检测MS和NMO/NMOSD患者血浆和脑脊液(cerebrospinal fluid,CSF)中白介素21(interleukin 21,IL-21)、NMO/NMOSD组患者血浆和CSF中水通道蛋白4免疫球蛋白G抗体(aquaporin-4 immunoglobulin G antibodies,AQP4-Ig G)的水平。应用流式细胞仪分选HC组、MS组和NMO/NMOSD组外周循环中的记忆性Tfh细胞,分别与HC组外周循环中的CD19+B细胞进行共培养。用流式细胞仪检测培养体系中记忆性B细胞(CD27+CD19+B cells)及其亚型、浆细胞(CD38+CD19+B cells)的表达,用ELISA技术检测共培养体系上清液中Ig G、Ig M和Ig A的水平。研究结果:(1)MS组患者治疗前外周循环中的记忆性Tfh细胞和可诱导的共刺激分子(inducible co-stimulator,ICOS)+记忆性Tfh细胞的数目,与HC组相比明显增高。MS组患者治疗前外周循环中CC趋化因子受体7(CC-chemokine receptor7,CCR7)+记忆性Tfh细胞和CCR7+ICOS+记忆性Tfh细胞的数目,与HC组相比明显增高。(2)MS组患者治疗前血浆中IL-21的水平,与HC组相比明显增高。MS组患者治疗前CSF中IL-21的水平,与非炎症性神经系统疾病(non-inflammatory neurological diseases,NND)组相比明显增高。(3)MS组患者治疗前外周循环中ICOS+记忆性Tfh细胞的数目分别与患者的EDSS评分、血浆IL-21的水平成正相关。MS组患者治疗前外周循环中CCR7+ICOS+记忆性Tfh细胞的数目分别与患者的EDSS评分、血浆的IL-21水平、CSF的IL-21水平、CSF的Ig G水平、CSF的抗髓鞘碱性蛋白的自身抗体(myelin basic protein antibody,MBP-Ab)水平和CSF的抗髓鞘少突胶质细胞糖蛋白自身抗体(myelin oligodendrocyte glycoprotein antibody,MOG-Ab)水平成正相关。(4)HC组和MS组患者治疗前外周循环中记忆性Tfh细胞分别与HC组的CD19+B细胞进行共培养。MS组共培养体系中CD27+CD19+B细胞和Ig D-CD27+CD19+B细胞在CD19+B细胞中所占的百分比,与HC组相比明显增高。MS组共培养体系中CD38+CD19+B细胞在CD19+B细胞中所占的百分比,与HC组相比增高。MS组共培养体系上清液中Ig M、Ig G的水平,与HC组相比明显增高。(5)激素治疗MS后,达到完全缓解(complete remission,CR)的MS患者(MS-CR组)外周循环中的记忆性Tfh细胞、ICOS+记忆性Tfh细胞、CCR7+记忆性Tfh细胞和CCR7+ICOS+记忆性Tfh细胞的数目,与治疗前相比明显减少。MS-CR组患者治疗后血浆中的IL-21水平,与治疗前相比明显减少。(6)激素治疗MS后,达到部分缓解(partial remission,PR)的MS患者(MS-PR组)外周循环中的记忆性Tfh细胞及其亚型的数目,与治疗前相比没有这种明显减少的趋势。MS-PR组患者治疗后血浆中的IL-21水平,与治疗前相比没有明显减少的趋势。(7)NMO/NMOSD组患者治疗前外周循环中的记忆性Tfh细胞、ICOS+记忆性Tfh细胞、CCR7-记忆性Tfh细胞、CCR7-ICOS+记忆性Tfh细胞、CCR7+记忆性Tfh细胞和CCR7+ICOS+记忆性Tfh细胞的数目以及在CD4+T细胞中所占的百分比,与HC组相比明显增高。(8)血清AQP4-Ig G阳性的NMO/NMOSD组患者治疗前外周循环中的记忆性Tfh细胞、ICOS+记忆性Tfh细胞、CCR7-记忆性Tfh细胞、CCR7-ICOS+记忆性Tfh细胞、CCR7+记忆性Tfh细胞和CCR7+ICOS+记忆性Tfh细胞的数目以及在CD4+T细胞中所占的百分比,与血清AQP4-Ig G阴性的NMO/NMOSD组相比没有明显差异。(9)NMO/NMOSD组患者治疗前血浆中IL-21的水平,与HC组相比明显增高。NMO/NMOSD组患者治疗前CSF中IL-21的水平,与NND组相比明显增高。(10)NMO/NMOSD组患者治疗前外周循环中的CCR7-记忆性Tfh细胞和CCR7-ICOS+记忆性Tfh细胞在CD4+T细胞中所占的百分比分别与患者的年复发率(annualized relapse rate,ARR)、血浆IL-21的水平成正相关。血清AQP4-Ig G阳性的NMO/NMOSD组患者治疗前外周循环中的CCR7-记忆性Tfh细胞和CCR7-ICOS+记忆性Tfh细胞在CD4+T细胞中所占的百分比分别与血浆AQP4-Ig G的水平成正相关。NMO/NMOSD组外周循环中的CCR7+记忆性Tfh细胞和CCR7+ICOS+记忆性Tfh细胞在CD4+T细胞中所占的百分比分别与CSF的白细胞数、CSF的蛋白水平、CSF的IL-21水平成正相关。(11)HC组和NMO/NMOSD组患者治疗前外周循环中记忆性Tfh细胞分别与HC组的CD19+B细胞进行共培养。NMO/NMOSD组共培养体系中CD27+CD19+B细胞和Ig D-CD27+CD19+B细胞在CD19+B细胞所占的百分比,与HC组相比明显增高。NMO/NMOSD组共培养体系中CD38+CD19+B细胞在CD19+B细胞所占的百分比,与HC组相比明显增高。NMO/NMOSD组共培养体系上清液中Ig M、Ig G的水平,与HC组相比明显增高。(12)激素治疗后,达到部分缓解的NMO/NMOSD患者(NMO/NMOSD-PR组)外周循环中的CCR7-ICOS+记忆性Tfh细胞和CCR7+ICOS+记忆性Tfh细胞的数目,与治疗前相比明显降低。NMO/NMOSD-PR组患者治疗后血浆中的IL-21水平,与治疗前相比明显减少。(13)激素治疗后,未缓解(non-remission,NR)的NMO/NMOSD患者(NMO/NMOSD-NR组)外周循环中的CCR7-ICOS+记忆性Tfh细胞和CCR7+ICOS+记忆性Tfh细胞的数目,与治疗前相比无明显变化。NMO/NMOSD-NR组患者治疗后血浆中的IL-21水平,与治疗前相比无明显变化。结论:(1)MS组和NMO/NMOSD组患者外周循环中不同亚型的记忆性Tfh细胞表达增多,其功能分子IL-21的水平升高。MS组和NMO/NMOSD组患者外周循环中的记忆性Tfh细胞诱导B细胞分化成记忆性B细胞和浆细胞、促进抗体分泌的功能增强。这表明记忆性Tfh细胞可能参与MS和NMO/NMOSD疾病的发病,并且有可能成为新的治疗靶点。(2)在MS患者中,外周循环中的CCR7+ICOS+记忆性Tfh细胞可能参与CNS中炎症性病灶的形成,也可能成为评估疾病活动性和严重性的生物学标志物。(3)在NMO/NMOSD患者中,外周循环中的CCR7-记忆性Tfh细胞和CCR7-ICOS+记忆性Tfh细胞可能参与血浆AQP4-Ig G的产生,也有可能成为评估疾病复发的标志;而CCR7+记忆性Tfh细胞和CCR7+ICOS+记忆性Tfh细胞可能参与疾病CNS中的炎症反应。(4)激素治疗可以调节部分MS患者和部分NMO/NMOSD患者外周循环中记忆性Tfh细胞、IL-21的异常表达,促进正常免疫稳态的恢复。