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第一部分: 卡介苗激活杀伤细胞诱导T24细胞凋亡的形态学研究 目的:卡介苗(BCG)是浅表性膀胱肿瘤一项有效的治疗,但其机制尚未详尽阐明。本实验旨在研究淋巴因子激活的杀伤细胞(LAK)和卡介苗激活的杀伤细胞(BAK)两种膀胱癌杀伤细胞诱导膀胱肿瘤细胞系T24的凋亡的形态学变化和规律。并探讨吖啶橙/溴化乙锭(AO/EB)双荧光染色在贴壁细胞凋亡研究中的应用。 方法:采取8名健康志愿者外周静脉肝素化血20ml,应用淋巴细胞分离液获取外周血单个核细胞(PBMNC)。应用BCG(3.75×10~4cfu/ml)、IL-2(800~U/ml)刺激PBMNC,分别作为BAK细胞、LAK细胞,不加刺激原组作为NK细胞组,6孔培养板中以RPMI1640完全培养液培养7天后得到三种效应细胞。膀胱肿瘤细胞系T24以5×10~4/ml的细胞悬液密度在96孔板中培养,每孔100μl体积,24h后细胞处在生长期,按照效靶比25:1将BAK、 浙i工人丰叩1:学L沦义·中上扭茎 LAK和NK三组免疫细胞加至T24中,分别作用Zh、4h、sh、12h后,轻 轻洗去淋巴细胞,并直接在培养板中进行AO/EB双荧光染色,倒置在荧光显 微镜的观察台上,以360斗 的蓝紫光和紫外光激发波长激发荧光,观 察、拍摄。 进一步的实验以4h为效靶细胞作用时间,洗去淋巴细胞后,分别在 oh、4h、12h时间段荧光染色观察拍照。每组取3个复孔,重复两次。照片 冲印后在计算机辅助下计数凋亡细胞,得出凋亡指数。并以一张200倍数照 片的视野范围作为一个单位视野,评价残留贴壁细胞数。同时进行苏木素染 色显微镜下观察,并在扫描电镜和透射电镜下观察确认凋亡。所有结果以图 表显示,统计分析应用 SpSS10.0软件。 结果:无论BAK、LAK还是NK细胞均可诱导凋亡的发生。AO/EB荧 光染色及荧光显微镜观察发现:正常T24细胞桩形或多角形生长,细胞异型 性明显,呈现为绿色或黄绿色,在细胞较疏时,凋亡细胞少,细胞生长密集 时凋亡增多,凋亡细胞细胞核呈现为橙红色,胞浆为淡红色,细胞外观形态 如常或皱缩。悬浮的T24肿瘤细胞和悬浮的淋巴细胞的荧光染色观察见多量 凋亡细胞。 l、多个效靶细胞作用时间组。以AO./EB荧光染色及荧光显微镜观察、 拍照,评价凋亡。(l)LAK作用刀 时杀伤能力已非常明显,作用Zh、 4h、Sll、12h 时的平均凋亡指数分别为:21.13%、40.02%、35.09%、 46.43%;单位视野平均贴壁细胞数为:66、57、36、22。(2)BAK作用4h 时才显现一定的抗肿瘤活性,作用Zh、4h、sh、回Zh时的平均凋亡指数分 别为:7.73%、10.67%、14.6%、1*68%:单位视野平均贴壁细胞数为: 176、137、131、126。(3)\K抗肿瘤作用弱,延长作用时间并未增加抗肿 瘤效果,作用Zh、4b、sh、门h 时的平均凋亡指数分别为:1乙33%、 8.47%、7.27%、10.59%:单位视野平均贴壁细胞数为:156、152、149、 150。()正常对照组也有一定的凋亡发生,平均凋亡指数为3.49%。单位 秒江人学厂1-学L论义·中上搁芙 视野平均贴壁细胞数为:189。 2、效靶细胞作用4h时间组。效靶作用后不同时间段m、4h、12h) 在荧光显微镜下观察、拍照,各个时间段的凋亡情况不同。*)BAK在 oh、4h、12h平均凋亡指数分别为:6.03%、4.52%、11.07$2 单位胭平均 贴壁细胞数为:398. 370、263。(2)LAK在oh、4h、12h平均凋亡指数 分别为:6.15%、8.96$、3.SCh;单位视野平均贴壁细胞数为:335、328、 280。(3)NK在 oh、4h、12h平均凋亡指数分别为:3.47%、2.80%、 3.86%:单位视野平均贴壁细胞数为:357、358、361。(4)正常对照组平 均凋亡指数为:1.95%;单位视野平均贴壁细胞数为:539。 3、苏木素染色发现存在核固缩,细胞核浓染的细胞,但由于肿瘤细胞的 异型性,难以确认凋亡。而在扫描电镜中发现:BAN与T24作用4h后继续培 养24h,T24细胞减少,细胞间界限不清,没有绒毛。LAK组T24细胞稀疏, 不规则,细胞表面平滑,绒毛较短,绒毛脱落痕迹明显,细胞境界欠清,可 见少量淋巴细胞锚附。NK组T24细胞绒毛减少,细胞较正常稀疏,细胞间隙 增大。透射电镜示各组细胞均有胞质皱缩,染色质边聚,核呈半月形改变。 结论:l、实验证明,在卡介茵免疫机制中细胞介导的免疫参与其中, B厂G和IL上 $活的杀伤细胞BAK、LAk均具有明显的诱导凋亡发生的活 性,死亡机制可能也介入其中。2、BAK细胞是