第一部分： 卡介苗激活杀伤细胞诱导T24细胞凋亡的形态学研究 目的：卡介苗(BCG)是浅表性膀胱肿瘤一项有效的治疗，但其机制尚未详尽阐明。本实验旨在研究淋巴因子激活的杀伤细胞(LAK)和卡介苗激活的杀伤细胞(BAK)两种膀胱癌杀伤细胞诱导膀胱肿瘤细胞系T24的凋亡的形态学变化和规律。并探讨吖啶橙／溴化乙锭(AO／EB)双荧光染色在贴壁细胞凋亡研究中的应用。 方法：采取8名健康志愿者外周静脉肝素化血20ml，应用淋巴细胞分离液获取外周血单个核细胞(PBMNC)。应用BCG(3．75×10~4cfu／ml)、IL-2(800~U／ml)刺激PBMNC，分别作为BAK细胞、LAK细胞，不加刺激原组作为NK细胞组，6孔培养板中以RPMI1640完全培养液培养7天后得到三种效应细胞。膀胱肿瘤细胞系T24以5×10~4／ml的细胞悬液密度在96孔板中培养，每孔100μl体积，24h后细胞处在生长期，按照效靶比25：1将BAK、 浙i工人丰叩1：学L沦义·中上扭茎 LAK和NK三组免疫细胞加至T24中，分别作用Zh、4h、sh、12h后，轻 轻洗去淋巴细胞，并直接在培养板中进行AO／EB双荧光染色，倒置在荧光显 微镜的观察台上，以360斗 的蓝紫光和紫外光激发波长激发荧光，观 察、拍摄。 进一步的实验以4h为效靶细胞作用时间，洗去淋巴细胞后，分别在 oh、4h、12h时间段荧光染色观察拍照。每组取3个复孔，重复两次。照片 冲印后在计算机辅助下计数凋亡细胞，得出凋亡指数。并以一张200倍数照 片的视野范围作为一个单位视野，评价残留贴壁细胞数。同时进行苏木素染 色显微镜下观察，并在扫描电镜和透射电镜下观察确认凋亡。所有结果以图 表显示，统计分析应用 SpSS10．0软件。 结果：无论BAK、LAK还是NK细胞均可诱导凋亡的发生。AO／EB荧 光染色及荧光显微镜观察发现：正常T24细胞桩形或多角形生长，细胞异型 性明显，呈现为绿色或黄绿色，在细胞较疏时，凋亡细胞少，细胞生长密集 时凋亡增多，凋亡细胞细胞核呈现为橙红色，胞浆为淡红色，细胞外观形态 如常或皱缩。悬浮的T24肿瘤细胞和悬浮的淋巴细胞的荧光染色观察见多量 凋亡细胞。 l、多个效靶细胞作用时间组。以AO．／EB荧光染色及荧光显微镜观察、 拍照，评价凋亡。（l）LAK作用刀 时杀伤能力已非常明显，作用Zh、 4h、Sll、12h 时的平均凋亡指数分别为：21．13％、40．02％、35．09％、 46．43％；单位视野平均贴壁细胞数为：66、57、36、22。（2）BAK作用4h 时才显现一定的抗肿瘤活性，作用Zh、4h、sh、回Zh时的平均凋亡指数分 别为：7．73％、10．67％、14．6％、1＊68％：单位视野平均贴壁细胞数为： 176、137、131、126。（3）＼K抗肿瘤作用弱，延长作用时间并未增加抗肿 瘤效果，作用Zh、4b、sh、门h 时的平均凋亡指数分别为：1乙33％、 8．47％、7．27％、10．59％：单位视野平均贴壁细胞数为：156、152、149、 150。（）正常对照组也有一定的凋亡发生，平均凋亡指数为3．49％。单位 秒江人学厂1－学L论义·中上搁芙 视野平均贴壁细胞数为：189。 2、效靶细胞作用4h时间组。效靶作用后不同时间段m、4h、12h） 在荧光显微镜下观察、拍照，各个时间段的凋亡情况不同。＊）BAK在 oh、4h、12h平均凋亡指数分别为：6．03％、4．52％、11．07＄2 单位胭平均 贴壁细胞数为：398． 370、263。（2）LAK在oh、4h、12h平均凋亡指数 分别为：6．15％、8．96＄、3．SCh；单位视野平均贴壁细胞数为：335、328、 280。（3）NK在 oh、4h、12h平均凋亡指数分别为：3．47％、2．80％、 3．86％：单位视野平均贴壁细胞数为：357、358、361。（4）正常对照组平 均凋亡指数为：1．95％；单位视野平均贴壁细胞数为：539。 3、苏木素染色发现存在核固缩，细胞核浓染的细胞，但由于肿瘤细胞的 异型性，难以确认凋亡。而在扫描电镜中发现：BAN与T24作用4h后继续培 养24h，T24细胞减少，细胞间界限不清，没有绒毛。LAK组T24细胞稀疏， 不规则，细胞表面平滑，绒毛较短，绒毛脱落痕迹明显，细胞境界欠清，可 见少量淋巴细胞锚附。NK组T24细胞绒毛减少，细胞较正常稀疏，细胞间隙 增大。透射电镜示各组细胞均有胞质皱缩，染色质边聚，核呈半月形改变。 结论：l、实验证明，在卡介茵免疫机制中细胞介导的免疫参与其中， B厂G和IL上 ＄活的杀伤细胞BAK、LAk均具有明显的诱导凋亡发生的活 性，死亡机制可能也介入其中。2、BAK细胞是