内源性绵羊肺腺瘤病毒NM株全基因序列的克隆、序列分析

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为了扩增内源性绵羊肺腺瘤病毒NM株全基因序列,参照GenBank中已发表的内源性绵羊肺腺瘤病毒的基因组全序列,设计合成七对引物,从经临床病理学检查健康无病绵羊的子宫组织中提取总DNA,分别使用内源性绵羊肺腺瘤病毒特异性探针和外源性绵羊肺腺瘤病毒特异性探针,进行斑点杂交鉴定。然后用鉴定后的子宫总DNA为模板,对enJSRV-NM株基因组分7段进行PCR扩增,产物分别为7个(618bp, 2006bp, 1106bp, 1613bp, 1145bp, 1861bp, 613bp)特异性基因片段,将其分别克隆入pMD19-T载体中进行双向测序并用DNAstar软件进行序列拼接与序列分析,获得完整的enJSRV-NM株基因组全序列。结果表明,enJSRV-NM株基因组全长7942bp,有相互重叠的4个较长的开放阅读框(ORF),分别代表gag、pro、pol和env基因,此外在pol基因的3’末端重叠一个额外的开放阅读框(orf-x)。与内源性南非代表毒株enJS56A1的基因序列比较,核苷酸同源性为99.2%;与外源性美国代表株JSRV21的基因序列比较,核苷酸同源性为92.3%。分析enJSRV-NM株基因组结构,在gag基因上没有发现外源性exJSRV特有的ScaⅠ酶切位点,且在gag基因编码的NC区发现有2个较典型的“胱氨酸—组氨酸序列”,可形成锌指结构。在env基因编码的TM区没有发现外源性exJSRV特异性的“YXXM”基序。enJSRV-NM株推导出的氨基酸与国外报道的exJSRV推导的氨基酸进行同源性比较,在大多数区域同源性高达90%~98%,而有3个可变区(VR1、VR2和VR3),分别位于gag基因和env基因,gag基因内有2个可变区(VR1、VR2),另一可变区VR3位于env基因编码的TM区。应用生物信息学分析技术并对enJSRV-NM株gag基因、env基因所编码的蛋白分别进行蛋白结构预测,结果显示gag基因、env基因所编码的蛋白均为结构松散的蛋白分子。这也是我国首次报道的内源性绵羊肺腺瘤病毒基因的全序列,为我国科研工作者进行更深入的研究奠定基础。
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