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AGGF1(Angiogenic factor with G-patch and FHA domain1)是通过研究人类先天性静脉畸形肢体肥大综合征(KTS)而发现的编码一个新的血管生成因子的基因。体外实验表明,AGGF1同VEGF类似,在鸡胚实验中可以强烈促进血管生成。随后在斑马鱼体内研究中发现,AGGF1可以通过AKT通路影响静脉血管的发育;并且在后肢缺血小鼠模型基因治疗中能显著提高血管新生能力,抑制组织坏死。以上研究提示,AGGF1在血管生成(angiogenesis)和血管发生(vasculogenesis)过程中起到了非常重要的作用。血管再生是肿瘤生长和转移的基础,肿瘤组织局部缺氧条件下,可以诱导多种血管生成因子的表达。但是,AGGF1在肿瘤中的表达情况,其功能及其表达调控机制还尚未阐明。 本研究以泌尿系统中最常见的恶性肿瘤膀胱癌为研究对象,通过免疫组化的方法检测AGGF1蛋白在膀胱泌尿上皮细胞癌组织中的表达情况及其与膀胱泌尿上皮细胞癌的临床分级之间的关系。共收集59例样本,包括7例正常膀胱组织,30例低级别膀胱癌(LGUCC)组织和22例高级别膀胱癌(HGUCC)组织。根据免疫组化染色程度,AGGF1的表达程度可分为三种:强阳性,弱阳性,阴性。实验结果显示, AGGF1的强阳性表达在正常膀胱组织,LGUCC和HGUCC中分别为100%(7/7),80%(24/30)和18.2%(4/22),即AGGF1蛋白在HGUCC中几乎不表达或者表达很低,而正常膀胱组织和LGUCC中AGGF1蛋白高表达。统计分析结果显示,AGGF1的低表达与HGUCC显著相关。 根据文献报道,高级别膀胱癌比低级别膀胱癌更易发生组织局部缺氧。于是我们假设AGGF1蛋白在HGUCC中的表达下调是由于肿瘤组织缺氧造成的,并设计实验探讨AGGF1在缺氧条件下表达调控的分子机制。通过对细胞进行缺氧诱导培养,结果发现:在缺氧条件下,AGGF1蛋白水平明显减少,而mRNA水平和AGGF1蛋白质的稳定性无变化。以上实验结果提示,microRNA参与到缺氧条件下AGGF1蛋白的表达下调。首先,通过生物信息分析发现,microRNA-27a/b负调控AGGF1的表达。miR-27a/b过表达能够在蛋白水平上显著抑制AGGF1的表达;而抑制细胞中miR-27a/b的水平则能够明显增加AGGF1的表达量。而且miR-27a/b的抑制效应只发生在蛋白水平,对AGGF1 mRNA水平无影响。其次,缺氧条件下,细胞中miR-27a的表达量显著提高;且抑制miR-27a的表达后对细胞进行缺氧诱导培养,AGGF1蛋白水平不再减少。因此,miR-27a介导了缺氧诱导的AGGF1表达下调。进一步研究显示,AGGF1的表达下调可以减少缺氧条件下细胞的凋亡率,对肿瘤细胞起保护作用。综上所述,本研究揭示了一条新的调控高级别泌尿上皮癌发展的信号通路,即缺氧诱导miR-27a表达上调,进而降低细胞中AGGF1的蛋白水平。 AGGF1在高级别泌尿上皮癌中表达下调,提示其并不是以血管因子发挥作用,因为HGUCC要求更多的血管发生,即要求更多的AGGF1蛋白表达,可是结果反之。同时,HIF-1α在缺氧条件下可以诱导多种血管生成因子的表达,AGGF1的表达并不受HIF-1α的调控。因此,推测,AGGF1蛋白是个多功能蛋白。由于AGGF1是FHA结构域包含蛋白,而这类蛋白往往都参与到DNA损伤修复过程,并且在癌细胞中,AGGF1主要定位于细胞核。于是,利用体外非同源重组末端连接(NHEJ)损伤修复报告质粒系统检测 AGGF1在DNA损伤过程是否发挥作用。通过流式细胞仪对DNA损伤修复活性进行定量分析,结果显示,AGGF1能够明显抑制NHEJ的修复活性,发挥着DNA双链修复抑制因子的作用。进一步研究发现,过表达 AGGF1蛋白的肿瘤细胞对抗肿瘤药物—喜树碱的敏感性增加,从而提高药物疗效。同时对AGGF1的表达具有负调节作用的miR-27a/b也通过抑制AGGF1的表达参与到DNA损伤修复过程,揭示了miR-27a/b调控肿瘤耐药性的一个新机制。