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【鼻咽癌差异基因表达谱分析】本研究室曾利用上海博芯公司H80s高密度基因芯片构建了鼻咽癌基因组表达谱,利用监督聚类和Weighted Voting算法筛选到6个基因,包括鼻咽癌上调基因RB1、STMN1、DSP和下调基因SERPINB6、AGTRL1和SYTL2。该6个基因代表的分类预测模型能将鼻咽癌和鼻咽慢性炎症上皮很好的区分开来,可能是鼻咽癌的候选分子标志物。为充分挖掘所构建的鼻咽癌差异基因表达谱中所隐藏的表达规律,提炼出更有价值的生物学信息,本文利用微阵列显著性分析（significance analysis of microarray,SAM）软件再次分析了鼻咽癌差异基因表达谱数据,共有显著差异表达基因758个,其中鼻咽癌表达上调基因270个,表达下调基因488个,从而构建了鼻咽癌差异基因表达谱。用Ingenuity Pathway Analysis（IPA）在线通路分析软件、Gene Set Enrichment Analysis（GSEA）软件和DAVID软件等分析发现cell cycle pathway和TGFβpathway相关分子的变化与鼻咽癌发生密切相关。【鼻咽癌发病不同阶段分子标志物的鉴定】为进一步研究上述鼻咽癌差异表达基因、cell cycle pathway和TGFβpathway相关分子与鼻咽癌发生发展的关系及在鼻咽癌发生中的作用,评估这些差异表达基因是否可作为鼻咽癌的分子靶标,本研究制作了高密度点阵的鼻咽癌发病不同阶段的组织微阵列以验证这些差异表达基因相关分子的表达变化。筛选和鉴定鼻咽癌发病不同阶段生物靶点基因、寻找鼻咽癌早期诊断、侵袭转移、预后复发相关的分子标志物。具体如下:1.鼻咽癌发病不同阶段组织微阵列的构建利用本室已获得发明专利的组织芯片制备技术（专利授权号:ZL200410022818X）制备了包含正常鼻咽上皮、慢性炎症鼻咽上皮、不典型增生鼻咽上皮、鼻咽癌（含不同组织学类型、不同临床分期、有无淋巴结转移、放疗后正常及复发鼻咽癌组织）及癌旁组织的鼻咽癌发病不同阶段的含825个点阵的组织微阵列,包括淋巴瘤和喉癌标本及缺失组织,该微阵列共有896个点。其中正常和鼻咽炎性上皮141例、不典型增生鼻咽上皮98例、癌旁上皮88例、鼻咽癌（WHOⅠ型15例、WHOⅡ型402例、WHOⅢ型17例;临床分期Ⅰ期32例、Ⅱ期155例、Ⅲ期1 56例、Ⅳ期91例;有淋巴结转移283例、无淋巴结转移151例）、放疗后正常和复发的标本64例、淋巴瘤和喉癌标本57例。2.鼻咽癌差异表达基因的验证鼻咽癌发病不同阶段的组织微阵列证实在488个鼻咽癌表达下调基因中,SPLUNC1是鼻咽癌早期患病风险筛查的易感因子,NGX6、LTF与鼻咽癌侵袭转移密切相关,SPLUNC1、ClORF102、AGTRL1和SERPINB6与鼻咽癌临床进展密切相关,LTF、BRD7和C1ORF102能预测鼻咽癌患者预后。其中LTF、C1ORF102、SPLUNC1、BRD7、NAG7、NGX6是我室克隆的鼻咽癌候选抑瘤基因,AGTRL1和SERPINB6是我们前期用监督聚类和weighted voting算法筛选到的鼻咽癌候选分子标志物。结合鼻咽癌发病不同阶段组织微阵列和real-time quantitativeRT-PCR证实cell cycle pathway中p27、p16、CDK4、RB1、CDK8等分子与cDNA microarray结果变化一致。利用鼻咽癌发病不同阶段组织微阵列证实TGFβpathway中TGFβⅡR、ACVRL1、INHBB、Axin2和p300/CBP分子在鼻咽癌中异常活化,说明cell cycle pathway和TGFβpathway在鼻咽癌发生发展过程中可能起到重要的作用。并且证实了EBV感染是鼻咽癌的一主要特征,鼻咽癌中cell cycle pathway和TGFβpathway的活化与EBV的感染密切相关。3.构建鼻咽癌发病不同阶段的分子标志物系统通过运用转录组学和组织微阵列等高通量技术,在大样本的基础上筛查并鉴定了SAM软件分析得到的鼻咽癌差异表达基因及我室克隆的鼻咽癌候选抑瘤基因SPLUNC1、C1ORF102、BRD7、NAG7、NGX6基因以及cell cycle pathway、TGFβpathway相关分子的表达,构建了鼻咽癌发病不同阶段的分子标志物系统:①证实SPLUNC1、p27、p16、p19是鼻咽癌早期诊断的理想分子标志物;②LTF、NAG7、SPLUNC1、ClORF102、CDK4、AGTRL1、INHBB和SERPINB6是与鼻咽癌临床进展相关的候选分子标志物;③NGX6、LTF、AGTRL1、INHBB和ACVRL1是与鼻咽癌淋巴结转移相关的候选分子标志物;④证实LTF、BRD7、CDK4、cyclin D1、RB1、EBER-1和ACVRL1是预测鼻咽癌放疗敏感与否的候选分子标志物;⑤LTF、BRD7、C1ORF102、ACVRL1、INHBB、cyclin D1是与鼻咽癌预后相关的候选分子标志物。鼻咽癌发病不同阶段的分子标志物的证实为鼻咽癌分子分型研究奠定了坚实的工作基础。【鼻咽癌差异表达基因相互作用网络的构建】将SAM软件筛选到的758个鼻咽癌差异表达基因输入IngenuityPathway Analysis（IPA）在线软件分析基因生物学功能和相互作用网络,137个基因在其基因网络数据库中,127个基因有功能/通路数据。变化最显著的有9个network,这些基因网络主要涉及DNA复制与修复、细胞周期、肿瘤发生、基因表达、细胞信号等方面。其中SPLUNC1参与了基因表达和肿瘤发生等生物学过程,并受维甲酸（retinoic acid,RA）调控,RA可能通过调控SPLUNC1的表达而抑制鼻咽癌细胞生长;SERPINB6参与了细胞运动和免疫应答等生物学过程。