引言热休克蛋白90α(HSP90α)的研究是肿瘤研究领域的热点。HSP90α是一种细胞内高表达的分子伴侣蛋白质,能与100多种目的分子结合,调节细胞各项生理功能。虽然人们研究HSP90α几十年,都知道细胞内HSP90α的含量非常巨大,但是细胞内HSP90α含量究竟是多少,却没有学者用实验的方法来测定。另外,人们普遍认同很多肿瘤细胞能分泌HSP90α至细胞外,分泌型HSP90α反作用于细胞,影响肿瘤细胞的生物学行为。可是,肿瘤细胞的HSP90α分泌机制以及分泌的HSP90α如何反作用于细胞,这样的研究却相对较少。在此,我们实验室设计本实验,对以上问题做一探讨。目的1.通过实验的手段测定不同细胞内HSP90α的含量,以期获得较准确的数据,解决HSP90α研究领域中一个重要的但却被人们忽略的问题。2.观察肿瘤细胞内缺氧诱导因子(HIF, HIF-1α和HIF-1β)对肿瘤细胞分泌HSP90α的影响。3.检测分泌至细胞外的HSP90α是否依赖低密度脂蛋白受体相关蛋白1(LRP1)对肿瘤细胞发挥生物学调控。方法1.将已知量的重组人HSP90α纯蛋白与细胞裂解液同时跑胶,用Western blot法让它们在同一张胶片上曝光,通过比较胶片上细胞裂解液组与HSP90α纯蛋白组的各点曝光斑密度值,计算细胞裂解液中HSP90α的含量。2.培养乳腺癌细胞MDA-MB-231,用小干扰RNA(siRNA)分别下调细胞内HIF-1α和HIF-1β的表达水平,Western blot法检测细胞分泌HSP90α的情况。3.培养乳腺癌细胞MDA-MB-231,用小干扰RNA(siRNA)分别下调细胞内HIF-1α、HIF-1β和LRP1的表达水平,进行细胞迁移和侵袭实验,观察分泌型HSP90α对细胞的作用及其作用机制。4.活体动物实验:使用严重联合免疫缺陷小鼠(SCID Mice)作实验模型,将1×106个荧光素酶标记的肿瘤细胞(MDA-MB-231-Luc和MDA-MB-468-Luc)从尾静脉注入小鼠。设计实验组小鼠注射MDA-MB-231-Luc细胞;对照组小鼠注射经siRNA下调了CD91水平的MDA-MB-231-Luc细胞和天生缺失CD91表达的MDA-MB-468-Luc细胞,在不同时间点进行活体成像监测。结果1.细胞内HSP90α的含量:HDF: 2.33%±0.16; HKC: 2.35%±0.26; HEMN-LP: 2.25%±0.62; HBL-100: 3.47%±0.36; SCC-12: 3.79%±1.31; MDA-MB-231: 3.66%±0.21; A431: 4.53%±0.70; M24: 6.77%±1.56.2.用siRNA下调HIF-1α或HIF-1β都能抑制MDA-MB-231细胞分泌HSP90α,此时的细胞迁移和侵袭能力降低。3.下调了LRP1表达水平的MDA-MB-231细胞侵袭能力下降。4.活体成像监测显示:与注射下调了CD91水平的MDA-MB-231-Luc细胞和天生缺失CD91表达的MDA-MB-468-Luc细胞的对照组小鼠相比,注射MDA-MB-231-Luc细胞的实验组小鼠表现出较强的成瘤能力。结论1.正常细胞内HSP90α占细胞总蛋白含量的2-3%;而肿瘤细胞内HSP90α则占细胞总蛋白含量的3-7%。2. MDA-MB-231肿瘤细胞表达HIF-1α→HIF-1α进核与HIF-1β结合形成二聚体→促使细胞分泌HSP90α→分泌的HSP90α与胞膜上受体CD91结合→增强细胞迁移和侵袭能力。