论文部分内容阅读
目的:探讨电针曲池、足三里穴是否通过激活MicroRNA-146b(miR146b)抑制Notch1的表达,促进MCAO/R大鼠缺血侧神经干细胞分化为神经元,改善神经运动功能,为临床电针治疗脑卒中后运动障碍提供理论依据。方法:1.将72只健康成年SD大鼠随机分为假手术组(n=12)、模型组(n=12)、电针组(n=12)、非穴组n=12)、模型+抑制剂组(n=12)和电针+抑制剂组(n=12)。参照Koizumi法制备左侧局灶性大脑中动脉缺血再灌注模型(middle cerebral artery occlusion and reperfusion,MCAO/R)。其中模型+抑制剂组和电针+抑制剂组在制备MCAO/R模型前30min进行miR146b抑制剂注射。在造模后第1天开始干预,电针组和电针+抑制剂组针刺患侧曲池、足三里穴,非穴组针刺患侧非穴部位,连接电针仪,波形为疏密波,频率为2/20HZ,每天1次,每次30min,持续21天。2.干预7、14、21天后,采用改良神经行为学评分(modifiedNeurologicalSeverity Scores,mNSS)评估各组大鼠神经运动功能;干预21天后,采用小动物核磁成像仪扫描大鼠T2WI结构像观察各组脑梗死情况;干预21天后,采用免疫荧光法观察缺血侧Brdu+/NeuN+以及Brdu+/DCX+表达情况;干预21天后,采用实时荧光定量法检测缺血侧纹状体miR146b相对表达量;干预21天后,采用免疫印迹法检测缺血侧纹状体Notch1、Mash1、NeuroD1相对表达量。结果:1.改良神经功能缺损评分结果显示:干预7、14、21天后,电针组大鼠mNSS评分低于模型组(P<0.05)和非穴组(P<0.05)。注射miR146b抑制剂后,模型+抑制剂组的mNSS评分较模型组降低(P<0.05),电针+抑制剂组的mNSS评分较电针组降低(P<0.05),而电针+抑制组的评分高于模型+抑制剂组的评分(P<0.05)。2.脑梗死体积结果显示：干预21天后,电针组脑梗死体积小于模型组(P<0.01)和非穴组(P<0.05)。电针+抑制剂组的脑梗死体积大于电针组(P<0.01)以及模型+抑制剂组大于模型组(P<0.01),而电针+抑制剂组的脑梗死体积低于模型+抑制剂组(P<0.05)。3.免疫荧光共标结果显示:干预21天后,与模型组相比,电针组大鼠缺血侧SVZ区和缺血侧纹状体区Brdu+/NeuN+共标细胞数增多(P<0.05)。注射miR146b抑制剂后,电针+抑制剂组和模型+抑制剂组缺血侧SVZ和缺血侧纹状体区Brdu+/NeuN+共标细胞数相比于电针组和模型组减少(P<0.05),但是电针+抑制剂组干预21天后缺血侧Brdu+/NeuN+表达高于模型+抑制剂组(P<0.05)。通过检测缺血侧SVZ区Brdu+/DCX+共标细胞来观察脑缺血再灌注损伤后未成熟神经元分化情况,发现电针组缺血侧室管膜下区Brdu+/DCX+共标细胞数少于模型组(P<0.05)和非穴组(P<0.050,模型+抑制剂组Brdu+/DCX+表达少于模型组(P<0.05),而电针+抑制剂组Brdu+/DCX+的表达少于模型+抑制剂组(P<0.05)。4.RT-qPCR结果显示:干预21天,电针组miR146b的表达高于模型组(P<0.05)和非穴组(P<0.05)。模型+抑制剂组miR146b的表达较模型组降低(P<0.05),电针+抑制剂组表达较电针组降低(P<0.05)。而与模型+抑制剂组相比,电针+抑制剂组miR146b的表达增加(P<0.05)。5.免疫印迹法检测结果显示:与模型组相比,电针组在干预21天后缺血侧纹状体区Mash1和NeuroD1的表达增加(P<0.05),而Notch1的表达减少(P<0.05)。注射miR146b抑制剂后,与模型组相比,模型+抑制剂组Mash1和NeuroD1的表达降低(P<0.05),Notch1的表达升高(P<0.05);与电针组相比,电针+抑制剂组Mash1和NeuroD1的表达降低(P<0.05),Notch1的表达升高(P<0.05)。比较电针+抑制剂组和模型+抑制剂组的蛋白表达发现,电针+抑制剂组Mash1和NeuroD1的表达增加(P<0.05),而Notch1的表达减少(P<0.01)。结论:电针曲池、足三里穴通过激活miR146抑制Notch1的表达,促进缺血侧成熟神经元分化,可能是电针改善MCAO/R大鼠神经运动功能的机制之一。