论文部分内容阅读
免疫球蛋白immunoglobulin(Ig)单体是由两条相同的分子量较大的重链和两条相同的分子量较小的轻链组成,而重链和轻链是由不同染色体上的多基因座编码的,在不同的鱼类中具有不同的基因组织方式。主要以分泌形式存在于血液和其它体液中介导体液免疫,由于鱼类抗体生物学功能的多样性所以可以识别外界为数众多的抗原,所以在抵御病原感染过程中发挥着重要作用,是鱼类特异性体液免疫应答中最主要的介质。在免疫应答过程中其产生不仅有一定的规律,同时还受多种因素的影响。因此,对鱼类Ig的研究理所当然地成为鱼类免疫学研究的重点和热点。
本研究中,利用分子生物学技术,对军曹鱼Ig κ和Ig μ的全基因进行了全长克隆、序列分析以及这两种基因在不同组织中的分布进行了研究,为进一步探明Ig的功能及其在疾病发生、发展过程中的作用提供了基础数据。本研究共分为3部分内容:
1、军曹鱼Ig κ基因的克隆及序列分析。采用同源克隆和RACE技术,克隆了军曹鱼(Rachycentron canadum)Ig κ轻链的cDNA全序列。军曹鱼Ig κ的cDNA全长969bp,3的非编码区域(UTR)为188bp,5UTR为52bp,开放阅读框为729bp,编码242个氨基酸,分子量大约为26.255kD,理论等电点为7.52。同源分析结果显示,军曹鱼、(穌)鱼(1,2,3)、斑点叉尾鲴的G、鲤鱼的L1A等轻链聚为一支,可以判断此轻链属于κ型;恒定区结果显示:军曹鱼、(穌)鱼、大西洋鲑的L3、斑点叉尾鲴的G等鱼的轻链均为κ型聚为一支,大西洋鲑的L2、斑马鱼的L2、鲤鱼的L2均为λ型聚为一支。而可变区的氨基酸与其鱼类可变区的氨基酸相比又有很大差别。
2、军曹鱼Ig μ基因的克隆及序列分析。筛选由军曹鱼头肾构建的cDNA文库,分离得到免疫球蛋白Ig μ的部分片段,通过RACE技术获得Ig μ基因的全长序列。通过同其他物种Ig μ基因氨基酸的比较分析显示,军曹鱼Ig μ基因的氨基酸同其他已描述过的物种的很相似。与已报道的鸡的Ig μ氨基酸的全长的相似性为26％,家鼠的27％,兔子的26％。与板鳃类,两栖类以及其他鱼类IgM氨基酸的比较结果如下:小型鲸的为28％,沙洲鲨25％,铰口鲨26％,非洲爪蟾33％,热带爪蟾30％,牙鲆58％,虹鳟40％,斑马鱼39％,普通鲤鱼30％,大西洋鳕鱼40％,草鱼36％,海鲢36％,这个结果显示鱼类免疫球蛋白之间的相似性明显的高于同其他物种的。
3、Ig κ和Ig μ链基因在军曹鱼不同组织中的表达。发现Ig κ链基因在健康鱼体中在肝脏和鳃中的表达量较高,在肠和脑组织中几乎没有表达。经JT2刺激192h后,在采样的各个组织中均有表达,尤其以头肾、肠、鳃和脾中的表达量较正常水平明显升高,反而肝的表达量有所下降,脑组织有Ig κ链基因的少量表达。说明经刺激后头肾、脾脏、肠是Ig主要的表达场所,在抵御病原感染过程中发挥着重要作用。
利用荧光定量RT-PCR技术在mRNA水平上检测Ig μ在军曹鱼不同组织中的表达,在健康的军曹鱼中,Ig μ在脾脏中的表达量较高,在脑、鳃、肾、心脏、胃、头肾和肠中也有表达,但是在这些器官不同的时间点Ig μ的表达量较少或是没有检测到荧光信号,因此脾脏在免疫前期发挥着主要的免疫角色。而经鲨鱼弧菌(JT2)刺激96h至192h时,结果显示Ig μ在肾脏、头肾中的表达量明显增多,而在其他组织中的表达量较少。
浸泡的实验结果显示Ig μ基因在皮肤、肾脏中的表达量7d时达到最大值,在脾脏、肠3d时达到最大值,在鳃、肝脏中的表达量5d时达到最大值,而在头肾中的表达量14d时达到最大值,但是在刺激后的每个时间点的这些组织中,鳃中的Ig μ基因的表达量都是较高的。因此浸泡的实验结果显示在有外源抗原刺激的情况下,不仅鳃发挥着重要的角色,头肾、肾脏也发挥着更重要的角色。