C2H2型锌指基因是高等动物基因组中最大且最复杂的基因超家族,在人与小鼠基因组中拥有数百个成员。本实验室使用生物信息学分析,并结合NCBI数据库筛选得到一人源锌指基因ZNFD,基因号为NM_182761,对ZNFD基因进行生物信息学方法分析,结果表明ZNFD为C2H2型锌指蛋白的一员,该锌指基因尚未见相关研究,故本实验室对该基因展开了以下几个方面的初步研究。
　　 首先,通过RT-PCR的方法从睾丸组织cDNA中克隆获得ZNFD基因,经测序鉴定ZNFD基因序列的正确性。利用生物信息学方法对ZNFD基因和蛋白进行分析,表明ZNFD基因位于第5号染色体,定位在5q23.1。ZNFD cDNA由5个外显子和4个内含子组成,含有990bp的开放阅读框,编码一个由329个氨基酸组成,分子量为37kDa的蛋白。对ZNFD基因进行组织表达谱分析证实ZNFD基因在前列腺、睾丸、脑、胰、子宫中表达,且睾丸和脑组织中表达量较高。通过生物信息学软件CLUSTAL W分析7种物种的ZNFD基因的同源性,分析表明目的蛋白的17-260aa有较高的保守性。
　　 通过构建真核表达重组质粒pEGFP-C1-ZNFD,细胞亚定位分析结果显示ZNFD蛋白定位于细胞核。同时为了鉴定ZNFD蛋白的N端氨基酸序列与锌指模序对ZNFD蛋白细胞核定位的影响,分别构建了一系列截短型ZNFD与绿色荧光蛋白表达载体(pEGFP-C1)的重组质粒,转染Hela细胞进行细胞亚定位分析,证明了ZNF结构域对于ZNFD蛋白的核定位不是必须的。
　　 大量研究证明ZNF蛋白多为转录因子,因此,本文进一步对ZNFD在特定的信号通路中是否有转录调控作用进行了分析。运用Dual-荧光酶报道基因分析系统来检测ZNFD是否对AP1(PMA),GRE,SRE,p53,CRE,HSE,NF-kB和AP1的信号路径有转录调控作用,且.ZNFD蛋白对AP1(PMA)有剂量依耐性激活。数据表明ZNFD蛋白导致AP1(PMA)转录活性的增强,pAP1(PMA)-TA-luc质粒含有AP1元件,该质粒专门用来监控蛋白激酶C转导路径的转录调控作用。这说明ZNFD可能作为蛋白激酶C信号途径的转录激活因子来介导调控细胞的一系列功能。另外,串联亲和纯化(TAP)为一种两步亲和纯化方法,该方法适用于分离类似生理条件下的蛋白互作复合体,因此我们构建了TAP-ZNFD真核表达载体,为后续寻找ZNFD互作蛋白奠定基础。