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白粉病是危害葡萄生产的主要真菌病害之一。本课题组对葡萄白粉病进行了长期、系统的研究,对于该病的发病机理、鉴定方法、遗传特性以及通过分子生物学手段进行基因定位、克隆、蛋白质融合表达等方面进行了大量的研究,取得了一定的进展。中国葡萄属野生种及其杂种对于多种真菌病害具有很强的抗性,是优良的抗病育种种质资源。植物抗坏血酸过氧化物酶(APX)是发现和研究较早,且其酶学特性、分布、定位、作用机理、生理功能和分子生物学特性比较清楚的重要酶类。本实验所用基因APX是从中国葡萄属野生种华东葡萄株系高抗白粉病的白河-35-1中经mRNA差显和RACE扩增技术获得的与抗白粉病相关基因。氨基酸序列同源性分析表明,中国葡萄属野生种APX与其它植物的同源性介于79%-88%之间。本实验首先通过基因克隆构建重组质粒pGEM-T-APX,后经酶切、重组将目的基因APX与表达载体pWR306定向连接并构建植物表达载体pWR-APX,冻融法导入农杆菌株GV3101制备成工程菌,然后探索了无核葡萄皇家秋天叶片再生方法,最后采用农杆菌介导法转化葡萄叶片,对该基因转化进行初步研究。实验得出了以下结果:1.以华东葡萄白河-35-1的cDNA第一链为模板,以已克隆的中国葡萄属野生种抗坏血酸过氧化物酶(APX)基因序列设计特异引物PCR扩增出目的片段,回收、酶切并与克隆载体pGEM-T easy连接,转化大肠杆菌DH5α,蓝白斑筛选获得阳性克隆。重组质粒pGEM-T-APX酶切鉴定后,送公司测序,结果表明该序列为769bp,为一完整的阅读框架,编码250个氨基酸。2.双酶切克隆载体pGEM-T-APX和表达载体pWR306,回收目的基因,连接后转化大肠杆菌感受态细胞,构建了植物表达载体pWR-APX。经酶切鉴定目的片段已定向连接到了表达载体pWR306中。3.采用冻融法将重组表达质粒pWR-APX导入农杆菌GV3101,卡那霉素和庆大霉素筛选阳性克隆, PCR检测表明重组质粒已导入GV3101中,制备了工程菌。4.在重组质粒的鉴定中用菌液、菌落和质粒三种介质为模板分别进行PCR,其中菌液直接PCR可以得到菌落和质粒PCR相同的结果,在今后重组质粒的鉴定及其它方面可以加以利用。