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哺乳动物DNA甲基化主要指CpG岛的甲基化修饰，是一种重要的表观遗传模式，与基因激活、基因印记、细胞分化与发育、以及衰老和癌变等一系列生命过程密切相关，是当今分子生物学领域研究热点。虽然CpG岛甲基化的分析方法发展较为迅速，但因目前缺乏有效的高通量甲基化分析方法，以致严重阻碍了这些生命活动调控规律的研究。基因芯片是近十几年来发展极快的一项技术平台，具有高通量、高灵敏度、快速自动等显著的特点，目前已应用于基因表达谱分析、新基因发现、基因突变及多态性分析等多项分子研究领域，CpG岛甲基化检测芯片也有所发展，但速度缓慢。针对这一需要，本论文发展了三种类型甲基化检测芯片，为实现更高通量甲基化分析芯片的制备，还对CpG岛数据库的构建做了大胆探索。具体内容如下：
(1)IGFBP7基因甲基化谱寡核苷酸芯片分析技术研究IGFBP7是一种胰岛素样生长因子结合蛋白编码基因，这种蛋白能够通过与IGF-2结合来调节细胞生长和抑制有丝分裂活性，对于卵泡发育及胚胎的生长发育都具有重要的调控作用，而且也是一种重要的肿瘤抑制基因。本研究的目的旨在开发一种用于IGFBP7基因甲基化谱分析的寡核苷酸芯片。该方法的步骤为：提取正常人血液乖人类乳腺癌组织样本基因组DNA，进行亚硫酸氢盐修饰，修饰过后的基因组DNA中甲基化的胞嘧啶保持不变，而未发生甲基化的胞嘧啶则转变为尿嘧啶，以修饰后的DNA为模板进行PCR扩增，扩增引物为测序引物，也就是将引物设计在不含有CpG二核苷酸的位点上，结果导致所扩增区域未甲基化胞嘧啶转化为胸腺嘧啶，而甲基化的位则不发生变化。其中以正常人血液基因组DNA为阴性对照样本，而M.sssI处理的(这种酶的处理可以导致所有基因组中CpG二核苷酸中的胞嘧啶都发生甲基化)正常人血液基因组DNA为阳性对照。对于肿瘤样本，由于各个片断甲基化的状态不同，扩增的PCR产物就可能是各种甲基化状态的一种混合物。本研究针对PCR产物中18个CpG位点设计了6对寡核苷酸探针，每对探针包含2-4个CpG二核苷酸位点，其中一条探针与甲基化的靶序列的相匹配，另一条探针与未甲基化的靶序列相匹配。将探针固定在处理后的DAKO玻片上，然后与CY3标记后的PCR产物杂交，激光扫描仪扫描并分析杂交结果。采用阳性克隆PCR产物与阴性克隆PCR产物参比建立定量检测曲线。参比实验发现，对于每对探针，PCR产物甲基化水平与荧光信号强度比值M/(M+U)有良好的线性相关性。本研究共检测了15对乳腺癌组织IGFBP7基因甲基化谱，发现所有样本中的所有位点甲基化程度都在85％以上，这种杂交结果采用亚硫酸氢盐测序法得到进一步证明。本实验的结果表明此芯片技术可以作为一种有用的工具进行IGFBP7基因多个CpG位点的甲基化谱定量分析。
(2)基于微阵列与双色荧光杂交的高通量分析甲基化检测芯片研究目前所报导的用于甲基化检测的芯片都是针对一个样本的多个基因或多个位点进行高通量分析，包括前一个实验也是如此，这些方法都不能同时分析大量样本以利于有效筛选生物标记物。因此建立一种高通量分析大量样本的基因芯片方法具有重要意义。在本研究中发展了一种新的方法，具体操作为：首先提取人类乳腺肿瘤样本基因组DNA，并准备阴性和阳性样本(方法同上)，将基因组DNA进行亚硫酸氢盐处理，以亚硫酸氢盐处理的DNA为模板进行PCR扩增，将PCR产物固定在多聚赖氨酸处理的玻片上，做成PCR产物芯片。设计一对包含三个相邻的CpG位点探针，一条探针是针对发生甲基化的靶序列，采用CY5(红色)标记，另一条是针对未甲基化的靶序列，采用CY3(绿色)标记，用双色荧光标记的探针与芯片杂交，杂交信号通过扫描仪不同滤光片扫描后分别获取CY5或CY3信号强度，信号采用GenepixPro3.0软件处理，通过绿色信号强度与红色信号强度的对比来确定样本甲基化的含量。阴性和阳性PCR产物参比实验发现，样本甲基化含量与CY5/(CY5+CY3)的比值呈良好的线性相关(R2=0.9871)，将该技术应用于检测20例乳腺癌组织、6例相对应的正常乳腺组织和一株肝癌细胞系共27个样本的IGFBP7基因的甲基化状态，发现除血液组织样本是阴性外，其他都呈阳性，此结果与前一个实验的结果相一致，并得到进一步测序证明。此项研究结果表明该方法能够用于大规模样本甲基化定量分析，对于筛选甲基化分子标记基因具有广阔的应用前景。
(3)基于尼龙膜杂交和地高辛标记的一种高通量甲基化基因芯片研究前一个研究获得的方法虽能够高通量定量分析大量样本甲基化状态，具有广阔的应用前景，但其检测灵敏度不高，为了提高检测灵敏度和适用范围，本研究又发展了亚硫酸氢盐修饰靶序列DNA芯片方法。与第二种方法不同之处在于将杂交载体由玻片变为尼龙膜，因为尼龙膜固定DNA量较大而且固定效率较高；第二个不同之处，在于将探针标记物由荧光标记改为地高辛标记。地高辛是近年来发展起来的一种高灵敏度的检测方法，可以取代同位标记用于Southernblot和Northernblot检测；第三个不同之处在于本研究还将本研究首先亚硫氢盐转化的基因组DNA直接固定在尼龙膜上制作基因组DNA芯片。首先将样本基因组DNA亚硫酸氢盐转化并进行PCR扩增，扩增出来的PCR产物固定在尼龙膜上进行甲基化分析。为了获得该方法的灵敏度，将阳性PCR产物片段与阴性PCR产物片段按不同比例混合成甲基化含量不同的样本固定制作成芯片，另外还将阳性基因组DNA和阴性基因组DNA按不同比例混合成甲基化含量不同的样本。同时还将亚硫酸氢盐处理的基因组DNA在带有阳离子的尼龙膜上，制作亚硫酸氢盐修饰靶序列DNA阵列。然后与标有地高辛的探针杂交，采用化学发光的方法来检测杂交信号。结果发现，固定的乳腺癌肿瘤样本与正常人血液组织样本检测结果与前二种方法检测的一致，并得到进一步的克隆测序证明。直接参比阴性和阳性PCR产物可以发现该杂交体系每个点可以检测到3.05×105拷贝数片段，而参比阴性和阳性基因组DNA结果发现，可以从40960个正常甲基化DNA中检测到一个非正常DNA样本；将1μg基因组DNA固定于尼龙膜上，选取合适的探针和杂交温度，可以区分甲基化的等位基因，由此证明这两种方法是可靠灵敏的，具有大规模检测等位基因甲基化程度较低的样本而且具有从大量样本中高通量筛选甲基化分子标记物的应用潜力。
(4)基于抑制性差减杂交技术构建CpG岛文库的方法学研究构建CpG岛文库是发展某些高通量DNA甲基化分析芯片的基础与前提，目前构建CpG岛文库的方法较为烦琐而且筛选也较为困难，本研究将抑制性差减杂交技术和甲基化特殊检测原理相结合，旨在发展一种简便的构建CpG岛文库的方法。此方法将正常人血液基因组DNA酶切后的片段的接上接头，然后作甲基化敏感酶HPAⅡ酶切，再进行Linker-PCR，其产物作为Driver；M.SssⅠ酶处理的人类基因组DNA酶切后作为Tester，接上接头之后Tester做一步HAaⅡ酶切。经过两次杂交后，然后将杂交产物进行两次抑制性PCR，并将PCR产物克隆入载体，挑取克隆分别进行PCR和测序检测差减杂交效果，结果发现在挑取的288个克隆中，PCR扩增有121个克隆插入的片段大于100bp，选取12个PCR扩增出来的克隆进行测序，共有7个克隆得到理想的测序结果，差减效率为58.3％，在这些测序片段中，有三条序列GC含量较高，而且CpG位点较多；其他四条序列，含有CCGG这样一段HpaⅡ酶切位点。这些结果表明，该方法可以作为构建CpG岛文库的理想工具。此外，该方法还可作为一种重要工具比较分析两种组织之间的甲基化。