印度芥菜(Brassica juncea)是一种重金属超富集植物，对Cd、Cr、Ni、Zn、Cu、Au、Se、Pb等多种重金属都具有较高的富集能力，是研究重金属耐性和超富集的模式植物。与油菜属中其他两种植物甘蓝型油菜和白菜型油菜相比，印度芥菜具有较强的抗旱、寒和抗病能力。本论文研究以印度芥菜为实验材料，研究分以下两个部分：第一部分采用RACE-PCR的方法，从Cd胁迫的印度芥菜中克隆得到2个SK2型脱水蛋白BjDHN2和BjDHN3，并对其基因结构、表达模式和功能进行了研究；第二部分对印度芥菜金属阳离子输出蛋白BjCET2和BjCET3基因的表达模式和功能进行了研究。　　 一、印度芥菜SK2型脱水蛋白BjDHN2和BjDHN3基因的克隆和功能分析　　 以Cd胁迫的印度芥菜为材料，采用RACE-PCR的方法，克隆得到2个脱水蛋白家族的新基因，分别命名为BjDHN2和BjDHN3。Southern杂交分析表明，BjDHN2和BjDHN3基因均以低拷贝的形式存在于印度芥菜基因组中。氨基酸序列分析表明，BjDHN2和BjDHN3是属于SK2型家族的酸性脱水蛋白(pI分别为4.93和5.5)。northern blot表明，BjDHN2和BjDHN3都是属于ABA响应的脱水蛋白，在植物体各器官中均有表达，在根中的表达量略高于茎叶部。低温、干旱和盐均可以诱导BjDHN2和BjDHN3的表达；重金属胁迫也可诱导BjDHN2和BjDHN3的表达。原核表达抗性分析结果表明，在干旱、高盐和低温条件下，重组菌中BjDHN2和BjDHN3蛋白的表达能够在一定程度上缓解旱、寒、盐胁迫对菌生长所产生的抑制作用。说明BjDHN2和BjDHN3具有耐寒、旱、盐保护作用。酵母耐受实验表明，转基因酵母能显著提高细胞对NaCl的抗性，说明BjDHN2和BjDHN3在高盐的解毒过程中发挥重要作用。抗冻能力分析表明，BjDHN2和BjDHN3可明显提高酵母在-20℃下的存活率。证明BjDHN2和BjDHN3可以防止在低温冷冻条件下蛋白质的变性和膜系统的损伤，阻止细胞内水分流失。　　 为进一步分析BjDHN2和BjDHN3在植物中的功能，我们构建了双子叶植物过表达载体转化烟草，构建了BjDHN3的反义表达载体转化印度芥菜，得到了转基因植株，并进行了抗逆能力分析。研究结果表明，BjDHN2和BjDHN3基因的表达，提高了烟草对低温、干旱、高盐和重金属胁迫的耐性。而转反义BjDHN3基因的印度芥菜幼苗在受到低温、干旱、盐和重金属胁迫后，抗性显著降低，其叶片相对含水量均低于转空载体的植株，相对电导率和MDA含量显著高于对照。短期逆境胁迫后的恢复生长实验表明，转BjDHN2和BjDHN3基因烟草的生长恢复速率均显著高于对照。这种相似的生理变化趋势，暗示BjDHN2和BjDHN3在植物抗重金属胁迫中发挥的作用可能和旱、盐胁迫相似，即在胁迫条件下的细胞抗脱水和抗氧化中起保护作用。对转基因植株Zn、Cd富集量分析发现，转反义BjDHN3基因的印度芥菜Zn、Cd富集量明显低于对照。说明抑制BjDHN3基因的表达，导致植物对重金属胁迫的抗性降低，因此富集量减少。我们的研究表明，BjDHN2和BjDHN3做为渗透保护物质，提高了细胞的抗脱水和抗氧化能力，从而提高了植物对各种非生物胁迫的耐性，尤其是在植物脱水胁迫后期的恢复过程中发挥重要的作用。　　 二、印度芥菜(Brassica juncea.L)BjCET2和BjCET3基因的功能分析　　 BjCET2和BjCET3是属于印度芥菜金属阳离子输出蛋白家族的成员。同源性比对和进化树分析发现，BjCET2、BjCET3与TcMTP1、TgMTP1和TaMTP1具有较高的同源性。暗示它们在功能上可能具有相似性。Southern杂交分析表明，BjCET2和BjCET3以低拷贝的形式存在于印度芥菜基因组中。northern blot分析表明，BjCET2和BjCET3在植物体各器官中均有表达，在根中的表达量略高于茎叶部。半定量RT-PCR和northern blot结果表明，BjCET2和BjCET3专一受重金属的诱导表达，而对旱、寒、盐胁迫均不应答。说明它们在植物重金属耐性和超富集过程中可能发挥重要的作用。　　 以双缺陷型酵母zrcl&cotl做为表达系统，对BjCET2和BjCET3的功能进行了分析。酵母互补实验结果表明，在0.04mM CdCl2、0.1mMZnCl2和1.0mMNiCl2胁迫下，转BjCET2和BjCET3酵母生长状况明显好于对照，说明BjCET2和BjCET3的过量表达提高了缺陷型酵母细胞对Cd、Ni和Zn的抗性。重金属富集量的分析表明，转BjCET2和BjCET3基因酵母对Cd和Zn的富集量明显降低。因此我们推测，转BjCET2和BjCET3基因的酵母可能是通过向细胞外排出重金属离子从而提高了细胞对重金属的耐受性。　　 对转基因植物的分析发现，转BjCET2、BjCET3和转反义BjCET2基因的植株在形态上出现了较大变化，过表达BjCET2和BjCET3基因的植株生长速度明显加快，叶片颜色较深，而抑制BjCET2基因表达的印度芥菜植株瘦小，结实率降低，叶片呈黄绿色。说明BjCET2和BjCET3蛋白的表达改善了植株的矿质代谢水平，有利于植物生长发育。转基因植株的重金属抗性实验结果表明，BjCET2和BjCET3的表达明显提高了植株对Zn和Cd的抗性，缓解了植物在重金属胁迫条件下对地上部生长的抑制。抑制BjCET2的表达则增加了植株对Zn和Cd的敏感性。定位研究发现，BjCET2-GFP和BjCET3-GFP融合蛋白主要在烟草叶片原生质体和根部的细胞膜上表达。采用ICP-MS对转基因植株的重金属含量分析发现，BjCET2、BjCET3的表达提高了植株地上部Zn、Cd的富集量。抑制BjCET2基因的表达则明显减少了印芥叶片的重金属富集量。植物超富集重金属的一个重要特征是茎叶部富集量明显高于根部，BjCET2和BjCET3基因的表达显著提高了植株地上部重金属富集量。因此我们认为，BjCET2和BjCET3在植物重金属超富集过程中发挥着重要作用。我们的研究表明，BjCET2和BjCET3基因在通过基因工程改良作物重金属抗性和富集能力上具有较大的应用前景。