前言:死亡时间(the postmortem interval, PMI)推断一直是法医侦破刑事案件的重点和难点,近年来,利用嗜尸性昆虫为刑事案件侦破提供线索的案例越来越多,其独特的优越性备受法医工作者的关注。麻蝇科很多种类的麻蝇都有应用于PMI推断的潜在价值。嗜尸性麻蝇准确、快速的种类鉴定是利用其进行PMI推断的关键步骤,然而至今许多嗜尸性麻蝇的幼虫仍没有系统的形态学鉴定要点,甚至一些雌性成虫(麻蝇属)仍然难以区分。因而,麻蝇在法医学实践中的应用受到严重制约。简便、快捷、有效的麻蝇种类鉴定方法是法医昆虫学亟待解决的一个难题。近年来,分子生物学技术的发展为嗜尸性麻蝇种类鉴定带来了曙光,大量研究证实线粒体DNA(mtDNA)分子标记可以用来进行嗜尸性麻蝇的种类鉴定。分子鉴定得以推广的前提条件是大量基因数据的存在。中国地域广阔,气候和地理环境复杂多变,麻蝇种类十分丰富,但尚无嗜尸性麻蝇的基因数据,这对法医昆虫学在国内的发展不利,也使全球嗜尸性麻蝇分子特性对比研究受到严重制约。因此,利用分子生物学技术研究不同基因片段对嗜尸性麻蝇的鉴定效力,寻找嗜尸性麻蝇的分子标记,建立我国嗜尸性麻蝇基因库十分必要。目的：1.收集嗜尸性麻蝇样本,对我国嗜尸性麻蝇常见种类、分布及嗜尸特性进行初步调查；2.改良、优化嗜尸性麻蝇DNA提取方法,研究不同基因片段对嗜尸性麻蝇的鉴定效力,尝试联合分析等分子鉴定方法,筛选出易于推广的嗜尸性麻蝇分子标记,初步建立我国嗜尸性麻蝇的基因库；3.尝试在实际案例中应用嗜尸性麻蝇对PMI进行推断,把分子鉴定运用到实践工作中。方法：1.根据不同地理纬度为划分依据,在全国范围内选取代表性区域,每年定期应用兔子、狗、猪等动物尸体诱捕各类嗜尸性麻蝇。按照形态学特征对样本进行初步分类、统计及编号。2.改良目前常用DNA提取方法,实现用少量组织获取足量的高品质DNA。探索目前国际上常用的引物序列,并根据蝇类mtDNA的COI、COⅡ、16SrDNA、ND1、Cytb等序列运用primer5软件设计引物序列。使用PCR试剂盒进行扩增,常规琼脂糖凝胶电泳检测DNA及PCR产物,扩增产物用胶回收试剂盒纯化,纯化产物批量测序。序列检测结果用Chromas v1.43、ClustalW等软件显示并截取等长度片段,再运用Mega v4.0软件进行聚类分析,根据结果筛选分子标记。将采集于我国不同地理、气候条件代表性地域的嗜尸性麻蝇基因数据上传GenBank,构建完善我国嗜尸性麻蝇基因库。3.在实际案例中,应用前期筛选出的分子标记鉴定嗜尸性麻蝇,根据已有发育资料尝试PMI的推断,探索嗜尸性麻蝇作为法庭证据的程序和方法。结果：1.2009-2011年对我国18省29个地区进行了麻蝇诱捕,共捕获包括棕尾别麻蝇(Boerttcherisca peregrine)、黑尾黑麻蝇(Helicophagella melanura)、白头亚麻蝇(Paras arc ophaga albiceps)、酱亚麻蝇(Parasarcophaga dux)、华南球麻蝇(Phallosphaera gravely)等麻蝇样本,进行初步形态学鉴定后筛选出272个样本,进行编号。2.改良后的SDS-PK法抽提效力较高,从麻蝇胸肌、头部、腿部、翅膀均可成功提取DNA。应用272-bp和278-bp的C0Ⅰ片段、289bp和555-bp的16Sr RNA片段、189-bp和637-bp的COⅡ片段用来区别常见嗜尸性麻蝇时,种间分化岐数一般都大于5%,个别种间甚至超过10%,但对于同一属不同种的种间分化岐数有时小5%；种内分化岐数一般都小于3%,很多个体种内差异为0。ND1及Cytb序列应用于麻蝇种类鉴定时效果较差。使用短片联合分析时,种间进化岐数和种内进化岐数明显更为合理,准确性较高。3.实践中应用分子标记进行种类鉴定是可行的,应用嗜尸性麻蝇对案件进行PMI推断的准确性要高于传统方法,但受较多因素影响,稳定性稍差。结论：1.通过大量动物演替实验,在我国部分地区进行嗜尸性麻蝇样本的采集,补充了嗜尸性麻蝇种类和分布资料。2.经过改良后的DNA提取方法,应用较少的组织(如单附足)既可获得足够量的DNA。短片段的(200-600bp)16Sr RNA、CO Ⅰ、COⅡ分子标记具有简便、快速、经济等优点,多片段联合运用可确保种类鉴定的准确性。3.GenBank中大量具有地域性代表性基因序列的上传,初步完成了我国嗜尸性麻蝇基因库的建立,为国外学者了解中国嗜尸性麻蝇分子特性开启一扇窗。4.在嗜尸性麻蝇基因库建立的基础上,实际案例中应用分子标记可以迅速、准确的完成麻蝇种类鉴定,进而解决PMI推断等法医学问题,促使法医昆虫学理论上升到实践高度。