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帕金森病（PD）的主要病变是脑部的黑质的细胞含黑色素的神经元大量死亡,以致纹状体内神经递质多巴胺（DA）减少。酪氨酸羟化酶（TH）是多巴胺合成代谢的限速酶,胶质源性神经营养因子（GDNF）对DA能神经元具有特异性营养作用,在纹状体同时引入TH、GDNF基因是理想的PD治疗方法之一。由于在脑内长期恒量表达TH、GDNF基因可能产生副作用,因此TH、GDNF基因的表达量需要依据患者的临床表现进行调控。Tet-Onon系统是专用于调控哺乳动物细胞基因表达的慢病毒载体,其表现的特性显示其应用于人类有很好的前景,但该系统因有相对高的基础表达而使其应用受限。本实验采用改良的Tet-Onon系统,其四环素调控的反式作用子为rtTA2s-M2,四环素应答元件（TRE）的启动子为小鼠白蛋白启动子（Palb）。在四环素类抗生素作用下,rtTA2s-M2与位于慢病毒载体上的TRE元件相互作用,启动Palb下游目的基因的表达。本实验目的采用改良的Tet-Onon系统,构建携带大鼠TH和GDNF双基因的慢病毒载体并包装成慢病毒（Lv-TH-GDNF）,在体内、体外观察四环素类抗生素对TH、GDNF基因的表达调控,并探讨Lv-TH-GDNF纹状体内直接转移对帕金森病（PD）大鼠的保护和治疗和保护作用。方法1、逆转录多聚酶链反应（RT-PCR）方法分别从P0 SD大鼠小脑组织、SD大鼠肾上腺组织获得大鼠GDNF、TH基因,将其克隆至含TRE的改良Tet-Onon系统调控的慢病毒转移载体pRRL-Palb-Luciferase-Ires-RFP,构建质粒pRRL-Palb-TH-Ires-GDNF。通过瞬间转染法包装生产慢病毒Lv-TH-GDNF,实时荧光定量PCR测定病毒滴度。将包装的Lv-TH-GDNF与rtTA2S-M2病毒以相同感染复数（MOI）感染Hela细胞,实时荧光定量PCR和免疫印迹法检测强力霉素（DOX）对TH、GDNF基因mRNA和蛋白的表达调控。实验分组:Hela组、Hela + Lv-TH-GDNF组、Hela+ Lv-TH-GDNF + rtTA2s-M2 + Dox(0、5 mg·L-1)组。2、Lv-TH-GDNF纹状体内直接转移对帕金森病（PD）大鼠的治疗和保护和治疗护作用实验。在Lv-TH-GDNF对PD模型大鼠的保护实验中,将Lv-TH-GDNF和rtTA2s-M2病毒早于6-羟基多巴胺（6-OHDA）一周注射,两次注射立体定位于SD大鼠左侧纹状体同一部位,用DOX诱导目的基因表达。实验分组:健康对照组、PBS对照组、Lv-TH-GDNF+ rtTA2S-M2+DOX组。在Lv-TH-GDNF对PD模型大鼠的治疗实验中,在6-OHDA损毁SD大鼠右侧内侧前脑束（MFB）后5周,将Lv-TH-GDNF与rtTA2s-M2病毒共同注射到大鼠右侧纹状体,用DOX诱导目的基因表达。实验分组:健康对照组、PBS对照组、Lv-TH-GDNF+ rtTA2S-M2组、Lv-TH-GDNF+ rtTA2S-M2+DOX组。在Lv-TH-GDNF对PD模型大鼠的保护实验中,将Lv-TH-GDNF和rtTA2s-M2病毒早于6-羟基多巴胺（6-OHDA）一周注射,两次注射共同立体定位于SD大鼠左侧纹状体,用DOX诱导目的基因表达。实验分组:健康对照组、PBS对照组、Lv-TH-GDNF+ rtTA2S-M2+DOX组。实验通过观察旋转行为、黑质TH免疫组化、高效液相色谱-电化学方法（HPLC-ECD）检测移植侧纹状体DA、DOPAC含量来评估Lv-TH-GDNF的治疗和保护效应;通过免疫荧光双标法、RT-PCR及免疫印迹法观察TH与GDNF在移植侧纹状体内的表达。结果1、实验显示成功构建重组慢病毒载体质粒pRRL-Palb-TH-Ires-GDNF;生产的慢病毒Lv-TH-GDNF浓缩后滴度为2.1×1011 TU·L-1 ;病毒感染Hela细胞后实时荧光定量PCR和免疫印迹显示强力霉素阳性组见TH、GDNF基因mRNA明显表达和蛋白条带,阴性组未见。2、①在Lv-TH-GDNF对PD大鼠的保护实验中,当6-OHDA损伤4周后（移植5周后）,与PBS对照组相比,Lv-TH-GDNF+rtTA2S-M2+DOX组大鼠阿扑吗啡（APO）诱发的旋转行为明显改善（p<0.01）,损伤侧黑质致密部TH阳性细胞数及纹状体DA含量均明显增高（p<0.01）。RT-PCR、免疫印迹结果显示,与PBS对照组比较,Lv-TH-GDNF+ rtTA2s-M2+DOX组大鼠移植侧纹状体TH、GDNF基因的表达明显增高（p<0.01）。②①在Lv-TH-GDNF对PD大鼠的治疗中,当6-OHDA损伤9周后（移植4周后）,与PBS对照组相比,仅Lv-TH-GDNF+ rtTA2s-M2+ DOX组大鼠旋转行为明显改善（p<0.01）（p<0.01 ）,损伤侧（移植侧）的黑质致密部TH阳性细胞数以及纹状体DA、DOPAC含量明显增高（p<0.01）（ p<0.01 ）。移植侧纹状体免疫荧光双标法显示Lv-TH-GDNF+ rtTA2s-M2+DOX组有TH和GDNF共表达的阳性细胞,量多;Lv-TH-GDNF+ rtTA2s-M2组亦能见到,但量极少;PBS对照组未见。免疫印迹结果显示,与PBS对照组相比,移植侧纹状体的GDNF、TH蛋白表达量在Lv-TH-GDNF+ rtTA2s-M2组虽有增加,但无显著性差异（p>0.05）,但Lv-TH-GDNF+ rtTA2s-M2+DOX组却明显增高（p<0.01）。②在Lv-TH-GDNF对PD大鼠的保护实验中,当6-OHDA损伤4周后（移植5周后）,与PBS对照组相比,Lv-TH-GDNF+rtTA2S-M2+DOX组大鼠阿扑吗啡（APO）诱发的旋转行为明显改善（p<0.01 ）,损伤侧黑质致密部TH阳性细胞数及纹状体DA含量均明显增高（ p<0.01 ）。RT-PCR、免疫印迹结果显示,与PBS对照组比较,Lv-TH-GDNF+ rtTA2s-M2+DOX组大鼠移植侧纹状体TH、GDNF基因的表达明显增高（ p<0.01 ）。结论:在改良的Tet-Onon系统调控的慢病毒载体上成功克隆大鼠TH、GDNF双基因,并成功包装了慢病毒Lv-TH-GDNF,在体外实验其目的基因的表达受四环素类抗生素调控并未见基础活动。当Lv-TH-GDNF直接转移到PD大鼠纹状体内,目的基因能在四环素类抗生素诱导下表达,可减缓6-OHDA诱发的大鼠DA能神经元进行性变性,改善阿朴吗啡诱发的PD大鼠旋转行为,提示其对PD大鼠具有保护和治疗作用。此外,改良的Tet-Onon系统在体内调控目的基因表达时存在微弱的基础活动。